养殖刺参腐皮综合症病灶处七株优势菌生理生化特性及其群体感应信号分子活性检测

摘要

随着国内刺参养殖业的迅速发展，养殖过程中相继出现了一系列病害问题，给刺参养殖业带来了巨大的损失。腐皮综合症因其传染性高，死亡率高而成为刺参养殖病害的研究重点。该病发病特征为：染病初期，先从口部出现感染症状，表现为围口膜松弛，触手对外界刺激反应迟钝，继而大部分刺参会出现排脏现象。中期感染的刺参身体收缩、僵直，一般口腹部出现小面积溃疡，形成蓝白色小斑点，渐渐丧失摄食能力。感染末期，病灶变大，溃疡处增多，最后导致刺参死亡，溶化成鼻涕状胶体。 关于刺参疾病的研究目前国内外均处于初级阶段，一是因为刺参病害是近几年才出现的；二是因为病害发生情况随机，没有规律可循；三是发病原因和过程多种多样，有种质抗病力差、机械损伤、养殖环境不良等内外因素，使问题更加复杂化。 为研究患病刺参腐皮综合症的发病机理及病灶处优势菌的性质和群体感应系统，本文以青岛某养殖场的养殖刺参为材料，对从患病刺参病灶部位分离纯化得到的七株优势菌，即：C6、4、TB、BP2、BP3、BP4、BP6，进行理化性质研究，结果表明，这七株菌生长较为迅速，TB、BP2和BP3在培养13小时左右便进入平台期：4、BP4和BP6培养19小时左右生长进入平台期；C6生长最慢，需要培养22小时后生长进入平台期。最佳培养条件为：盐度33～36‰，温度32℃左右，pH值7～8左右。抗生素敏感实验及生化指标测定的结果表明，这七株菌对氟嗪酸、氯霉素、先锋必、复方新诺明、红霉素、庆大霉素、氟哌酸等抗生素有广泛的抗性；在测试的20项生化指标中精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酶脱羧酶、脲酶、色氨酸脱氨酶、3-羟基丁酮酶均为阳性反应。 通过对七株优势菌进行群体感应信号分子的提取、纯化、鉴定等方面的研究发现，菌株C6、4、TB、BP2、BP3、BP4和BP6的群体感应信号分子确实存在，但是其产生量很少，与阳性对照有鲜明的对比。AHLs是由一个可变的乙酰基链尾部与一个稳定的高丝氨酸内酯头部相连，该结构在酸性条件下最稳定，强碱可能导致高丝氨酸内酯开环，从而破坏其结构。实验表明，七株优势菌株群体感应信号分子的活性与培养基pH值的变化基本上成反比，由此推测，在偏碱性的液体中，很可能会造成信号分子的分解而降低其活性。根据相关资料显示，刺参养殖池中移植大叶藻能够大幅减少腐皮综合症的发病几率。由此推测，大叶藻中很可能含有能够拮抗AHLs的活性物质，如果能将这种活性物质提取出来，将对防治刺参腐皮综合症有积极的意义。本研究为进一步探索养殖刺参腐皮综合症的发病原因、过程和新型抗菌手段以及其它致病菌的抗感染研究提供重要的参考，在水产养殖业的抗菌感染中具有理论价值和实际意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1养殖刺参病害

1.1刺参简介

1.2养殖刺参病害研究现状

2细菌的群体感应(QS)系统

2.1革兰氏阴性菌的QS系统

2.2革兰氏阳性菌的QS系统

2.3细菌用于种间交流的QS系统

2.4其他QS系统

3革兰氏阴性菌信号分子(AHLS)的分离纯化与检测

3.1信号分子(AHLs)的分离纯化

3.2信号分子(AHLs)的生物学检测

3.3信号分子(AHLs)的性质分析

3.4革兰氏阴性菌中常见的信号分子(AHLs)及其生物学功能(表1-1)

4革兰氏阴性菌群体感应信号分子(AHLS)的干扰

4.1抑制信号分子(AHLs)的生物合成

4.2信号分子(AHLs)的生物灭活及降解

4.3信号分子(AHLs)的化学失活

4.4信号分子(AHLs)的拮抗剂

4.5其他类型信号分子的拮抗剂

5展望

第二章病灶处优势菌的生理生化特性研究

1实验用品

1.1菌种

1.2实验仪器

1.3药品与试剂

2实验方法和主要试剂配方

2.1理化性质研究

2.2药敏试验

2.3优势菌生化指标鉴定

3实验结果

3.1理化性质研究

3.2药敏试验结果

3.3优势菌生化指标鉴定结果

4讨论

4.1养殖刺参腐皮综合症病原及病灶优势菌群

4.2养殖刺参腐皮综合症可行的解决方法

5小结

第三章病灶处优势菌的群体感应信号分子活性检测

1实验用品

1.1菌种

1.2实验仪器

1.3实验药品与试剂

1.4培养基配方

2实验方法

2.1信号分子(AHLs)的提取与活性检测

2.2 TLC薄层层析

3实验结果

3.1信号分子(AHLs)的活性检测

3.2待测菌各生长阶段培养液PH值与信号分子活性的关系

3.3 TLC薄层层析

4讨论

5小结

参考文献

致 谢

攻读硕士期间发表学术论文