用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物及其扩增引物和应用

摘要

本发明公开了用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物及其扩增引物和应用，特点是分子标记物miR-137的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，分子标记物miR-2008的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示，扩增miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.3所示，扩增miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，扩增RNU6B内参基因的正向引物的核苷酸序列为SEQIDNO.6所示，诊断刺参发病的方法为总RNA的提取、cDNA合成、PCR扩增和鉴定，优点是为刺参腐皮综合症的治疗提供指导，实现刺参腐皮综合症的早诊断、早治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物及其扩增引物和应用。

背景技术

刺参（Stichopus japonicus Selenka）隶属于棘皮动物门，刺参纲，楯手目，俗称海老鼠和海黄瓜。主要分布在我国大连、北戴河、山东半岛、江苏连云港及平山岛等沿海。伴随着刺参养殖产业的发展，以腐皮综合症为代表的病害问题逐渐成为制约产业发展的重要瓶颈。据不完全统计，2004-2013年由于病害造成的刺参产业经济损失每年30-40亿元。因此，构建以新型疾病响应分子标记物为核心的疾病预警系统是提高刺参产业经济效益的前题，是开展分子诊疗的基础。

microRNA(miRNA)是一类高度保守的，长约22nt的非编码小分子RNA，这类小分子广泛存在于动植物中并参与了包括细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等在内的多种生物学过程。miRNA可通过在转录或转录后水平上调控基因的表达来实现其相应的生物学功能，在多种疾病的发生和发展过程中扮演了极其重要的角色，因此，miRNA不但可以成为预测某些疾病发生的分子标记物而且还有可能成为治疗某些疾病的分子靶点。越来越多的研究证明，miRNA作为一种调控因子其表达水平的改变和多种疾病过程相关，目前以miRNA作为分子标记物的检测手段已被广泛应用于肺癌、乳腺癌以及糖尿病等疾病的早期诊断中。

刺参腐皮综合症由于其发病率高、传染快速、死亡率高且病原复杂等特征，使其难以得到快速的诊断和治疗，因此通过方便快捷的现代生物学技术检测来诊断刺参腐皮综合症具有重要意义。目前，国内外还没有公开任何关于利用miRNA分子作为刺参腐皮综合症发病早期预测或诊断的分子标记物来诊断刺参腐皮综合症的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用miRNA分子作为刺参腐皮综合症发病早期诊断的分子标记物，并提供用于刺参腐皮综合症发病早期诊断的分子标记物扩增引物。本发明还提供了利用该分子标记快速预警刺参腐皮综合症发生的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物，所述的分子标记物的基因片段如下：分子标记物miR-137基因片段的核苷酸序列为5’-UAUUGCUUGAGAAUACACGUAG-3’，分子标记物miR-2008基因片段的核苷酸序列为5’-AUCAGCCUCGCUGUCAAUACG-3’。

扩增权利要求1所述的miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列为：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增权利要求1所述的miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列为：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3，扩增RNU6B内参基因的正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。

一种用于刺参腐皮综合症早期诊断的试剂盒，包括权利要求2所述的扩增miR-137基因片段的正向引物：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’、扩增miR-2008基因片段的正向引物：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3以及扩增RNU6B内参基因的正向引物：5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。

一种刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物的检测方法，步骤如下：

a、总RNA的提取：取刺参体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入RNAiso-plus试剂（购于Takara公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm, 离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm, 离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1mL， 4℃，12000rpm, 离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液； 

b、cDNA合成：取500ng上述RNA提取液用miScript 反转录试剂盒（Qiagen, Germany）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；

c、PCR扩增：利用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行（Qiagen, Germany），20ul扩增体系：SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液1ul，cDNA溶液1ul，ddH₂O 补充至20ul ；扩增反应条件：95℃ 15 min，94℃ 15s，60℃ 30s，70℃ 30s，共40个循环，反应完成后进行熔解曲线分析；其中引物溶液包括扩增miR-137基因片段的正向引物：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增miR-2008基因片段的正向引物：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、 扩增miR-137基因片段和miR-2008基因片段的反向引物为通用引物，各引物浓度均为10uM，内参基因为RNU6B，扩增RNU6B内参基因用正向引物为5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’，反向引物为通用引物；

d、鉴定：扩增完成后，利用2^-△△CT方法分析基因表达量，若miR-137基因片段和miR-2008基因片段同时高水平表达，且表达倍数高于2.3则认为刺参处于腐皮综合症发病早期。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种预警刺参腐皮综合症的分子标记物及其疾病快速诊断应用，其中分子标记物为miR-137、miR-2008和RNU6B内参基因以及扩増miR-137、miR-2008和RNU6B的正向引物；诊断刺参发病的方法为总RNA的提取、cDNA合成、PCR扩增和鉴定，鉴定快速、简便、特异和有效，若两种miRNA同时高水平表达且表达倍数达到2.3，则断定改刺参处于发病早期，为腐皮综合症的治疗提供指导，实现刺参腐皮综合症的早诊断、早治疗，提高刺参的养殖效益，降低刺参腐皮综合症的危害。该标记物的发掘和应用为养殖刺参经济效益提升，良种的快速筛选试剂盒的研发提供了可能，为进一步认识刺参腐皮综合症的发生机制和分子设计育种奠定了基础。

附图说明

图1为PCR扩增获得的miR-137基因片段的溶解曲线图；

图2为PCR扩增获得的miR-2008基因片段的溶解曲线图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

刺参腐皮综合症发生指示分子标记物miR-137和miR-2008的筛选：2011年10月于辽宁省普兰店某室内刺参养殖场采集腐皮综合症发病刺参个体30个，健康个体30个，分别获取体腔液10.0mL，800g离心5min，收集体腔细胞。利用Ambion公司的mirVana miRNA 分离试剂盒纯化miRNA，交由上海晶能生物科技有限公司完成miRNA文库的构建和illumina Hiseq2000 测序平台的单端50bp 测序模式的高通量测序分析。经低质量序列去除、miRBase比对、参考基因组和Rfam数据库比对，获得了包含miR-137和miR-2008序列在内的多个miRNA序列。

刺参腐皮综合症发生指示分子标记物miR-137和miR-2008的鉴定：2012年2年从山东威海采集自然发病的刺参样品10只，健康样品10只，采用定量PCR技术分析了miR-137和miR-2008的表达水平。结果表明：与健康个体相比，发病刺参个体miR-137和miR-2008表达水平上调3.2倍以上，证实miR-137和miR-2008是指示刺参腐皮综合症发生的理想分子标记物。上述分子标记物miR-137基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-UAUUGCUUGAGAAUACACGUAG-3’，分子标记物miR-2008基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-AUCAGCCUCGCUGUCAAUACG-3’。其中RNU6B内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-CGUGAAGCGUUCCAUAUUUUAA-3’。

 实施例2

扩增上述实施例1的miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增上述实施例1的miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3，扩增上述实施例1的RNU6B内参基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。在进行实时荧光定量分析miR-137基因片段和miR-2008基因片段表达水平时，我们随机选择3个刺参样品进行。PCR结束后记录观察miR-137基因片段的溶解曲线(图1)和miR-2008基因片段的溶解曲线(图2)。溶解曲线为单峰图则表明扩增产物为特异性扩增。随后将扩增产物与pMD-18T载体（Takara，中国）连接，连接产物转化感受态大肠杆菌Top10F’，过夜培养，挑取单克隆10个，利用载体引物筛选阳性克隆送上海Invitrogen公司测序。测序结果经生物信息学分析，证实为刺参miR-137基因片段和miR-2008基因片段序列，表明反应的特异性。

实施例3

2012年3月，从宁波市奉化市博旺水产养殖有限公司中采集到发病刺参个体5只，未发病个体5只，采用下述方法验证试剂盒检测效率：

a、总RNA的提取：分别取刺参体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入RNAiso-plus试剂（购于Takara公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm, 离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min， 4℃，12000rpm, 离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度75%的乙醇1mL， 4℃，12000rpm, 离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液； 

b、cDNA合成：取500ng总RNA的上述提取液用miScript 反转录试剂盒（Qiagen, Germany）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；

c、PCR扩增：利用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行（货号218193，Qiagen公司，Germany），20ul扩增体系：SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液1ul，cDNA溶液1ul，ddH₂O 补充至20ul ；扩增反应条件：95℃ 15 min，94℃ 15s，60℃ 30s，70℃ 30s，共40个循环，反应完成后进行熔解曲线分析；其中引物溶液包括扩增miR-137基因片段的正向引物：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增miR-2008基因片段的正向引物：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、 扩增miR-137基因片段和miR-2008基因片段的反向引物为通用引物（核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG），各引物浓度均为10uM，内参基因为RNU6B，扩增RNU6B内参基因用正向引物为5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’，反向引物为通用引物（核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG）；

d、鉴定：扩增完成后，利用2^-△△CT方法分析基因表达量，其中发病组5个个体miR-137基因片段和miR-2008基因片段均呈现高水平表达，且表达倍数为健康组的3.0倍以上，表明试剂盒检测的准确性。

 实施例4

2011年2月，从宁波市奉化市博旺水产养殖有限公司中购买未有明显发病症状刺参20只，分别标号，采用下述方法计算每个个体的miR-137和miR-2008的相对表达水平，养殖15天，观察得病情况：

a、总RNA的提取：分别取刺参体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入RNAiso-plus试剂（购于Takara公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm, 离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min， 4℃，12000rpm, 离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度75%的乙醇1mL， 4℃，12000rpm, 离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液； 

b、cDNA合成：取500ng总RNA的上述提取液用miScript 反转录试剂盒（Qiagen, Germany）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；

c、PCR扩增：利用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行（Qiagen, Germany），20ul扩增体系：SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液1ul，cDNA溶液1ul，ddH₂O 补充至20ul ；扩增反应条件：95℃ 15 min，94℃ 15s，60℃ 30s，70℃ 30s，共40个循环，反应完成后进行熔解曲线分析；其中引物溶液包括扩增miR-137基因片段的正向引物：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增miR-2008基因片段的正向引物：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、 扩增miR-137基因片段和miR-2008基因片段的反向引物为通用引物（核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG），各引物浓度均为10uM，内参基因为RNU6B，扩增RNU6B内参基因用正向引物为5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’，反向引物为通用引物（核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG）；

d、鉴定：扩增完成后，利用2^-△△CT方法分析基因表达量，20个个体中，miR-137基因片段和miR-2008基因片段表达水平最高的3个个体(表达量为对照组的2.5倍以上)，在养殖的第5天，活动能力降低、出现厌食等症状，在地7天，体表出现了明显的化皮特征。

 实施例5

  2013年12月，从山东青岛购的养殖刺参15只，其中10只养殖于含高密度的病原菌灿烂弧菌海水中，另外5只则养殖于普通海水中，采用实施例1的方法计算miR-137和miR-2008的相对表达水平，结果如下：

a、总RNA的提取：分别取刺参体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入RNAiso-plus试剂（购于Takara公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm, 离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min， 4℃，12000rpm, 离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度75%的乙醇1mL， 4℃，12000rpm, 离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液； 

b、cDNA合成：取500ng总RNA的上述提取液用miScript 反转录试剂盒（Qiagen, Germany）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；

c、PCR扩增：利用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行（Qiagen, Germany），20ul扩增体系：SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液1ul，cDNA溶液1ul，ddH₂O 补充至20ul ；扩增反应条件：95℃ 15 min，94℃ 15s，60℃ 30s，70℃ 30s，共40个循环，反应完成后进行熔解曲线分析；其中引物溶液包括扩增miR-137基因片段的正向引物：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增miR-2008基因片段的正向引物：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、 扩增miR-137基因片段和miR-2008基因片段的反向引物为通用引物（核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG），各引物浓度均为10uM，内参基因为RNU6B，扩增RNU6B内参基因用正向引物为5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’，反向引物为通用引物（核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG）；

d、鉴定：扩增完成后，利用2^-△△CT方法分析基因表达量，病原菌感染组的miR-137基因片段和miR-2008基因片段均呈现不同的表达模式，其中个别个体在感染后的第1天miR-137表达量下调，其余个体的miR-137和miR-2008的表达水平均超过对照组的2.5倍以上。感染后3天，miR-137和miR-2008表达水平均上调的个体出现了化皮的一些特征，最终发病。

 上述实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围以权利要求书为准。