仿刺参(Apostichopus japonicus)“腐皮综合症”病灶处优势菌群群体感应系统初探

摘要

仿刺参营养丰富，体壁含有丰富的胶原成分和蛋白聚糖，其医疗保健作用得到了越来越广泛的认同和应用，同时形成了以中国等国家和地区为中心的贸易和消费市场。为了解决日益膨胀的市场需求，海参的人工养殖应运而生，而且得到了迅速的发展，然而随着海参大规模人工养殖的快速发展，病害问题日趋突出，出现了多种明显病症和大规模死亡现象，严重制约了该产业的健康发展。其中“腐皮综合症”因其高传染性、高死亡率而成为仿刺参养殖病害的研究重点。 目前海参疾病的预防和治疗主要使用化学药物和抗生素，这些药物的滥用己带来严重的环境问题并影响了水产养殖业的健康发展。通过对细菌群体感应系统及其信号分子的研究，进而设计出各种信号干扰方法来阻断群体感应信号传导从而应用于微生物感染的防治已成为研究的热点。 细菌群体感应信号分子的检测方法有物理检测法、生物检测法及TLC法。生物检测法由于其简单、快速、不需要特殊的实验仪器等优点而得到广泛的应用。 为研究仿刺参“腐皮综合症”与细菌群体感应系统之间的关系，本文首先利用仿刺参“腐皮综合症”病原菌C6对健康仿刺参进行人工感染，采用群体感应信号分子的高效检测菌株Agrobacterium tumefaciens KYC55检测人工感染后不同时间饲育水中群体感应信号分子AHLs的浓度，并在实验过程中对AHLs信号分子检测的实验条件进行了探索。实验结果表明，不同时期饲育水中均能检出一定浓度的AHLs但其浓度不同，患病仿刺参饲育水中AHLs的浓度较健康仿刺参明显升高，在发病初期的饲育水中这种差异尤其显著。 本文第二章研究了病原菌C6及各仿刺参病灶处优势菌AHLs信号分子的产生情况，采用报告菌株Agrobacterium tumefaciens KYC55对各优势菌不同生长时期培养上清中AHLs浓度进行初步检测，实验结果表明病原菌C6与病灶处优势菌4、TB、BP3和BP4都可产生AHLs类信号分子，细菌不同生长期培养上清中AHLs浓度不同，但它们均在细菌生长进入稳定期时达到最高。 本文第三章对病原菌C6及各优势菌培养上清中的AHLs信号分子进行提取浓缩，在实验过程中对AHLs信号分子的提取条件进行了优化，采用两种报告菌株Agrobacterium tumefaciens KYC55和Chromobacterler violaceum CV026对其中的AHLs信号分子进行进一步的定性及定量检测和分析。实验结果表明，酸化乙酸乙酯(含0.5％甲酸)为提取AHLs信号分子的最优体系，除菌株BP6以外，其它各优势菌均存在以AHLs为信号分子的群体感应系统，但不同细菌AHLs的活性及产生的AHLs的种类均有所差异，AHLs活性从高到到低顺序为4＞TB＞BP4＞BP3＞C6。 病原菌C6及各病灶处优势菌经鉴定均与海水养殖常见病原有较大的同源性，相关报道表明仿刺参“腐皮综合症”是由病原菌与其它海水养殖致病菌共同作用的结果；本研究发现水体中AHLs浓度与刺参疾病暴发之间存在一定的数量相关关系，且病原菌与5株病灶处优势菌均存在以AHLs为信号分子的群体感应系统。所以本文结果表明，仿刺参“腐皮综合症”的病发与细菌以AHLs作为信号分子介导的群体感应系统具有密切的相关性。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1棘皮动物门病原的研究情况

2海参病原研究概况

2.1细菌

2.2寄生虫

2.3病毒

2.4真菌

3刺参的主要细菌性疾病

3.1烂胃病

3.2烂边病

3.3化板症

3.4细菌性溃烂病

3.5腐皮综合症

3.6刺参“腐皮综合症”研究现状

4细菌群体感应系统

4.1细菌群体感应信号分子

4.2细菌群体感应机制

4.3革兰氏阴性菌信号分子(AHLs)的检测

4.4细菌群体感应与病原菌的致病力

4.5细菌群体感应系统研究展望

5本文研究目的及意义

第二章患病仿刺参养殖水体中AHLs信号分子的检测及其对仿刺参病发的影响

1实验用品

1.1实验材料

1.2实验试剂

1.3实验仪器

1.4实验溶液的配置

2实验方法

2.1 AHLs检测方法的优化

2.2致病菌的人工回接感染实验

2.3不同时间养殖水体中AHLs的检测

3实验结果与分析

3.1 AHLs检测方法的研究

3.2攻毒实验

3.3菌株C6半致死剂量实验

3.4不同时间养殖水体中AHLs的检测

3.5数据分析

4讨论

4.1AHLs检测方法的优化

4.2攻毒实验及菌株C6半致死剂量实验

4.3不同时间养殖水体中AHLs的检测

5本章小结

第三章仿刺参“腐皮综合症”病灶处优势菌AHLs信号分子的初步检测

1实验用品

1.1实验材料

1.2实验试剂

1.3实验仪器

1.4实验溶液的配置

2实验方法

2.1菌种的活化

2.2扩大培养

2.3细菌生长情况的测定

2.4信号分子粗提液的制备

2.5 AHLs活性检测

2.6数据分析

3实验结果与分析

3.1菌株C6信号分子(AHLs)的活性检测

3.2菌株4信号分子(AHLs)的活性检测

3.3菌株TB信号分子(AHLs)的活性检测

3.4菌株BP2信号分子(AHLs)的活性检测

3.5菌株BP3信号分子(AHLs)的活性检测

3.6菌株BP4信号分子(AHLs)的活性检测

3.7菌株BP6信号分子(AHLs)的活性检测

4讨论

5本章小结

第四章仿刺参“腐皮综合症”病灶处优势菌AHLS信号分子的提取纯化及检测分析

1实验用品

1.1实验材料

1.2实验试剂

1.3实验仪器

1.4实验溶液的配置

2实验方法

2.1信号分子(AHLs)的分离纯化

22信号分子(AHLs)的活性检测

2.3数据分析

3实验结果与分析

3.1信号分子(AHLs)的分离纯化

3.2信号分子(AHLs)的活性检测

4讨论

4.1信号分子(AHLs)的提取

4.2信号分子(AHLs)的活性检测

5本章小结

结语

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表学术论文