食源“超级细菌”快速筛检技术的构建

摘要

目前，随着进出口贸易技术壁垒花样的不断翻新，发达国家很有可能将进出口动物源性食品及饲料中的耐药致病菌设置为一种新的贸易技术壁垒，无论出于何种目的，耐药致病菌将在食品安全问题和进出口贸易上掀起一次大的波澜，所以，很有必要进行前瞻性的检测技术研究和分子流行病学调查，从而为我国政府应对国内外食品安全的突发事件提供技术支持。
　　因在检验检疫系统日常的食品、农产品微生物检测中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是常规五项检测中的必检项目，所以本论文选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这两种致病菌做为研究对象，试图建立一种快速筛检技术，来判断它们是否存在超级耐药基因。
　　本论文的主要研究内容是利用大肠杆菌NDM-1基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的序列特点，建立快速生化初筛技术和核酸层析胶体金快速检测技术，并完成PCR-核酸层析胶体金快速检测试剂条的研发，以满足当前口岸检疫新形势的需要。
　　1.对大肠杆菌NDM-1基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的菌株（为生物安全起见，实际为合成的带有超级耐药基因的质粒）进行分析，即两种基因的合成与重组质粒的构建。然后，针对这两种耐药基因分别建立经典的PCR检测技术体系，利用经典PCR技术对设计、合成的引物进行验证，确定引物的特异性和灵敏度。
　　2.对大肠杆菌NDM-1基因、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因进行基因排列，按照结构特点进行全面的信息收集，寻找、筛查保守区间。对其中目的片段序列进行比对分析，从中找出了满足PCR-核酸层析胶体金的特异性片段、特异性突变位点，建立PCR-核酸薄膜层析技术体系，并进行特异性和灵敏度的验证。利用这一技术来检测大肠杆菌的NDM-1基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因，实现了提高超级耐药基因NDM-1和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测速度的目的，特异性良好，灵敏度分别为5.6×102cfu/ml和8.3×102cfu/ml。
　　3.利用建立的方法对山东省内采集的样品进行分析评估，对设计的试剂条进行评定、改进。对使用过抗生素类的以禽畜肉为主的食品中是否存在“超级细菌”的危害进行了一次大规模的普查，进而对超级细菌是否会波及食品安全问题进行了一次比较科学的论证。
　　通过本论文的研究，分别构建了针对NDM-1基因和mecA基因的经典PCR检测技术体系及PCR-核酸层析胶体金快速检测方法。其中PCR-核酸层析胶体金快速检测方法特异性和灵敏度良好、省时省力，同时还能避免凝胶电泳对操作人员带来的健康问题。通过该方法对山东省内禽畜肉为主的食品中是否存在“超级细菌”进行了调查，进一步验证了该方法的实际应用价值。

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0 前言

0.1 超级细菌简介

0.2 NDM-1基因简介

0.3 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）简介

0.4 耐万古霉素肠球菌（VRE）简介

0.5 普通PCR技术简介

0.6 PCR－核酸薄层层析法简介

0.7 研究目的与技术路线

1 大肠杆菌NDM-1基因快速筛检技术

1.1大肠杆菌NDM-1基因的合成与重组质粒的构建

1.2大肠杆菌NDM-1基因经典PCR检测技术体系的建立

1.3 PCR-核酸薄膜层析法检测大肠杆菌NDM-1基因技术体系的建立

1.4 本章小结

2耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因快速筛检技术

2.1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的合成与重组质粒的构建

2.2耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因经典PCR检测技术体系的建立

2.3 PCR-核酸薄膜层析法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因技术体系的建立

2.4 本章小结

3. 大规模采样试用及调查评论

3.1 材料

3.2 方法

3.3大规模采样试用结果

3.4大规模采样试用结果讨论

4.论文总结

参考文献

致谢

个人简历

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