近海食源微生物产毒特性的基因分析及其快速检测研究

摘要

随着人口和人类需求的不断增长,以陆生生物来源的多糖类等生物活性物质的开发逐渐呈难以为继之势。海洋中蕴藏着极其丰富的天然产物,是人类寻找新的生物活性物质的最大库源,因此,海洋生物活性物质的研究开始备受关注。海洋动植物活性物质的真正生物源是海洋微生物,特殊的生活环境,使得海洋微生物具有显著的特性,集中体现在机体内含有许多结构特殊的生物活性物质和代谢产物。其中一些生物物质,虽然具有独特的生物活性,但是它们能够蓄积在海洋生物中,比如鱼、贝类体内,通过食物链传播给人类,造成人的食物中毒。因此,在合理开发利用海洋资源的同时,有必要对这类产毒素食源微生物进行深入研究。 本文以海洋亚历山大藻和副溶血弧菌作为研究对象,主要针对亚历山大藻麻痹性贝毒素的产生与藻自身遗传物质之间的关系、亚历山大藻产毒特性的遗传差异以及相关产毒基因等问题进行研究,并建立了恒温核酸扩增体系实现了对产毒亚历山大藻和非可培养状态下副溶血弧菌的特异性检测,以期为深入开发利用海洋生物资源过程中所引起的安全问题提供了理论研究基础和技术支持。主要研究内容和结果如下： 1、研究了亚历山大藻细胞在活体和乙醇固定状态下DNA的提取方法,并考察了固定剂乙醇的固定浓度、时间、温度等因素对固定细胞DNA降解率的影响。结果表明：冻融-CTAB方法提取的亚历山大藻细胞DNA纯度和得率较高,OD260 nm/OD280 nm的值基本都在1.75～1.90区间内,蛋白污染很少,OD260 nm/OD230 nm的平均值也都在1.96以上。乙醇的最佳固定浓度在5％,长期固定藻细胞应放置在-80℃,短期使用可放置4℃并尽量缩短放置时间。 2、对亚历山大藻株核糖体DNA的分子特征进行了分析,并且对亚历山大藻的产毒特性进行了遗传差异分析,结果表明：无毒藻株在5.8S rDNA-ITS核糖体区间与有毒株系差异较大,核苷酸差异值达到0.391,而无毒藻株之间核苷酸差异值较小,达到0.003。在分子生物学水平上证明了有毒株与无毒株在核糖体DNA序列上存在显著遗传差异；通过脉冲场凝胶电泳实验,在基因组水平上证明,亚历山大藻毒素的产生与自身基因组(遗传物质)有密切的关系；通过PCR-RFLP酶切图谱特征可以准确地将不同亚历山大藻种的产毒类型区分开,为麻痹性贝毒素的组分鉴定提供了一条新途径。 3、根据核糖体DNA在有毒藻与无毒藻之间的序列差异,以核糖体DNA为靶序列,设计有毒藻种特异性简并核酸扩增引物,建立新型恒温核酸扩增方法(LAMP),实现对有毒藻种的快速检测。结果表明:LAMP方法在65℃恒温条件下1h就完成对目标有毒藻种的检测。检测过程发现,LAMP扩增是非常特异性的,共存于同一体现中大量外源DNA并不影响扩增结果和效率；LAMP方法具有很高的灵敏度,最低可以检测到5个单细胞,是PCR灵敏度的10倍；通过添加荧光染料SYBR Green Ⅰ,阳性结果的绿色很明显区别于阴性结果橙色,灵敏度与凝胶电泳结果一致。 4、构建了微小亚历山大藻产毒株基因组文库。通过插入片段与载体的连接、转化以及平板筛选,获得1014bp大小的特异性重组片段,PCR验证该片段在有毒株中有强烈的扩增信号,而在无毒株中无扩增信号。利用反向PCR方法分析特异性片段旁侧DNA序列信息,获得其中一段240bp大小的核苷酸序列,其对应氨基酸序列翻译的对象是甲硫氨酰氨肽酶(MAP),氨基酸比对分析,其与芬地亚历山大藻MAP的氨基酸序列相似性达到97％。研究发现,这条核苷酸序列与已报道的序列在编码区完全相同,但是在终止密码子之外的非编码区突变了三个碱基,推测是由于微小亚历山大藻在生长代谢过程中,MAP执行了不同的生理功能需求,在转录水平上对毒素的产生进行了调控,map基因通过其编码产物对其他产毒相关基因进行了诱导,使其具有活性表达,开始毒素合成。 5、针对副溶血弧菌在低温和贫营养条件下不能增殖因而造成漏检的问题,建立了原位荧光恒温核酸扩增方法(in situ LAMP),实现毒素基因在恒温65℃条件下单细胞内原位大量扩增。结果表明：较低的反应温度减轻了对细胞结构的损坏,细胞完整固定在载玻片上,无脱落现象,获得的图像背景对比度很强；检测副溶血弧菌与溶藻弧菌的混合菌时,通过蓝光的激发,标记有荧光信号的副溶血弧菌被特异性检测出来；检测人工模拟污染样品时,检测结果没有受到杂质的影响,倒置荧光显微镜下可以检到单个细胞；通过与PCR方法和LAMP方法做比较,发现,原位荧光LAMP方法在检测48份副溶血弧菌样本时效果非常显著的,检测率在96％以上,灵敏度和特异性与LAMP方法相当,但是,它的检测限可以达到单个细胞并且可以更直观的观察到细胞存在状态。

目录

文摘

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论文说明：英文缩写词表

声明

第一章绪论

1.1麻痹性贝类毒素的研究概况

1.1.1麻痹性贝毒的来源和分布

1.1.2麻痹性贝毒的结构和性质

1.1.3麻痹性贝毒素的毒性

1.1.4麻痹性贝毒的致毒机理

1.2分子生物学技术在有毒藻种分析监测中的应用

1.2.1藻毒素毒害机理的分子生物学研究

1.2.2核糖体rDNA技术及其在分子微生物生态上的应用

1.2.3亚历山大藻种的分子生物检测技术

1.3 DNA环介导恒温核酸扩增法在病原微生物监测中的应用研究

1.3.1 LAMP方法的特点

1.3.2 LAMP方法的实际应用

1.4病原性海洋弧菌的研究现状

1.4.1副溶血弧菌及其致毒因子

1.4.2副溶血弧菌溶血毒素基因

1.4.3原位荧光恒温核酸扩增方法

1.5本论文的研究意义及研究内容

1.5.1研究背景及意义

1.5.2主要研究内容

第二章亚历山大藻活体及乙醇固定状态下DNA的微量提取

2.1引言

2.2实验材料与设备

2.2.1主要仪器和设备

2.2.2主要试剂和实验耗材

2.2.3实验藻株

2.2.4主要培养基和常用溶液的配制

2.3实验过程与方法

2.3.1冻融处理对微小亚历山大藻细胞破壁效果的影响

2.3.2冻融-CTAB方法提取亚历山大藻基因组

2.4结果与讨论

2.4.1亚历山大藻生长曲线

2.4.2不同生长期藻细胞破壁条件的研究结果

2.4.3冻融-CTAB法提取的基因组DNA检测

2.4.4固定剂乙醇对亚历山大藻基因组DNA降解率的影响

2.5本章小结

第三章亚历山大藻核糖体DNA分子特征及产毒特性的遗传差异研究

3.1引言

3.2实验材料与设备

3.2.1主要仪器和设备

3.2.2主要试剂和实验耗材

3.2.3实验藻株

3.2.4主要培养基和常用溶液的配制

3.3实验过程与方法

3.3.1亚历山大藻核糖体DNA分子特征分析

3.3.2脉冲场凝胶电泳分析亚历山大藻产毒株与无毒株的遗传差异

3.3.3 PCR-RFLP分析产毒株毒素组成与核糖体DNA的关系

3.4结果与讨论

3.4.1核糖体DNA序列的扩增和分析

3.4.2亚历山大藻5.8S rDNA-ITS区序列分子特征分析结果

3.4.3脉冲场凝胶电泳图谱分析遗传差异结果

3.4.4 PCR-RFLP结果分析

3.5本章小结

第四章DNA环介导恒温核酸扩增法快速检测产毒亚历山大藻的研究

4.1前言

4.2实验材料与设备

4.2.1主要仪器和设备

4.2.2主要试剂和实验耗材

4.2.3实验藻株

4.2.4培养基和常用溶液配制

4.3实验过程与方法

4.3.1藻细胞DNA的提取

4.3.2简并LAMP引物设计

4.3.3 LAMP反应过程

4.3.4 LAMP反应结果检测

4.3.5 LAMP技术的特异性评价

4.3.6 LAMP技术的灵敏度评价

4.4结果与讨论

4.4.1亚历山大藻LAMP反应特异性实验结果

4.4.2 LAMP方法与PCR方法用于检测微小亚历山大藻的灵敏度比较

4.5本章小结

第五章构建用于相关基因筛选的微小亚历山大藻产毒株基因组文库

5.1前言

5.2实验材料和设备

5.2.1主要仪器设备

5.2.2主要试剂和实验耗材

5.2.3实验藻株和菌株

5.2.4主要培养基和常用溶液的配制

5.3实验过程与方法

5.3.1亚历山大藻基因组DNA提取

5.3.2插入片段制备

5.3.3酶解DNA片段克隆至T载体

5.3.4大肠埃希菌DH5α感受态细胞的制备

5.3.5大肠埃希菌DH5α的转化实验

5.3.6转化子质粒提取

5.3.7序列测定及特异性鉴定

5.3.8反向PCR法分析与产毒相关DNA片段上游未知序列

5.4实验结果与讨论

5.4.1插入片段制备结果

5.4.2插入片段大小

5.4.3序列测定及特异性鉴定结果

5.4.4反向PCR引物设计与限制性内切酶选择

5.4.5反向PCR扩增产物分析

5.5本章小结

第六章原位荧光恒温核酸扩增方法的建立及其在副溶血弧菌检测中的应用

6.1前言

6.2实验材料和设备

6.2.1主要仪器设备

6.2.2主要试剂和实验耗材

6.2.3供试菌株

6.2.4主要培养基和常用溶液的配制

6.3实验过程与方法

6.3.1原位荧光恒温核酸扩增方法的建立

6.3.2原位荧光恒温核酸扩增方法的特异性

6.3.3原位荧光恒温核酸扩增方法的灵敏度

6.3.4原位荧光恒温核酸扩增方法有效性评价

6.4结果与讨论

6.4.1引物设计结果

6.4.2原位荧光恒温核酸扩增方法的特异性实验结果

6.4.3原位荧光恒温核酸扩增方法的灵敏度实验结果

6.4.4原位荧光恒温核酸扩增方法的有效性评价

6.5本章小结

结论与展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢