食品溯源用基于DNA检测的内标物示踪法研究

摘要

食品安全问题一直是社会热点问题,它直接关系着老百姓的生命健康。而针对现今食品制假掺假现象严重,食品溯源系统的建立不够完善以及其在应用过程中具有明显的缺陷等问题,一些研究者提出了内标物示踪法这一新的概念,其主要思想就是将特殊物质作为“内标物”加入到商品内用于该商品的跟踪和防伪鉴别。核酸分子由于具有物化性质稳定且安全性、特异性强等优点而成为“内标物”的首选,可以利用各种核酸扩增技术检测核酸这一“隐形的生物条形码”。为了弥补传统防伪鉴别技术的不足以及溯源系统应用中的缺陷,本研究试图建立多种基于核酸扩增技术的“内标物”示踪法,也使该方法的实际应用具有更加可靠的理论依据,使该方法得以推广。
　　本研究首先运用PCR技术和RCA(滚环扩增)技术分别对双链和单链DNA在九种常见液态食品中的稳定性进行了初步探究,结果显示:单双链DNA在大部分液态食品内均能够稳定存在,这为实际的应用提供了理论依据。只有核酸分子在液态食品内能够稳定存在,它才可以有作为“内标物”的资格。通过具体的检测实验,也就此建立了基于PCR和RCA这两种核酸检测技术的内标物示踪法,用于液态食品的溯源和防伪鉴别,其中PCR技术的检测限能达到10 fmol/L甚至1 fmol/L,而RCA技术的检测限为10 pmol/L。
　　相对于PCR和RCA扩增过程中都需要引物这一缺点,本文根据DNA重复序列的扩增特性研究以及DNA从头合成的相关研究,开发了一种新的无引物核酸高效扩增方法,该方法主要基于以下原理:DNA链末端的回文序列可以形成发卡结构,该发卡结构的3’-末端能够作为引物实现DNA链的延伸扩增。该技术可直接使用合成的长度为40~50nt的短链 DNA。结果显示:该扩增方法在单纯体系内效果良好,且在以白酒为应用对象的体系内也获得良好的效果,检测限能达到100 pmol/L。为提高检测限,在该扩增方法的基础上做出了改进,即在扩增反应体系内加入相应的内切酶来提高反应速率,其理论依据是DNA从头合成过程中的 Cut-grow扩增模型。结果显示,通过对实验方法的改进,其检测限能达到1 fmol/L,但该扩增过程中可能会有其他非特异性反应的发生,影响检测结果,还需更多相关研究来解决这一问题。总之,这一新的扩增技术操作简单,结果稳定。可以预测,在未来其在食品的源头追溯及真伪鉴别方面一定会有非常广泛的应用前景。
　　通过测量以d(cGCAg)和d(cGAAAg)为基础所构成的特殊茎环结构的Tm,判断该结构的热力学稳定性。将无引物核酸高效扩增技术与这一特殊茎环结构相结合,设计了一种类似的无引物核酸扩增方法,该方法的基本思想:DNA链末端能够形成稳定的茎环结构,该茎环的3’-末端能够作为引物引导延伸扩增。结果显示所设计的核酸序列能够扩增,为未来特殊茎环结构的应用以及其他核酸扩增技术提供了一些借鉴和参考。
　　综上所述,基于各种核酸检测技术,包括PCR、RCA扩增技术,以单双链核酸作为“内标物”对液态食品进行源头追溯和真伪鉴别这一方法具有很强的可行性,在未来会有非常广泛的应用。

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0前言

0.1 食品安全问题

0.2 食品溯源体系的研究现状

0.3 内标物示踪法的研究现状

0.4 DNA检测技术

0.5 DNA重复序列的扩增特性研究

0.6 茎环结构

0.7 本课题的主要研究内容和意义

1基于PCR与RCA技术建立“内标物”示踪法

1.1 引言

1.2 材料及仪器

1.3 双链DNA的在常见液态食品内的稳定性探究

1.4 完整双链DNA在常见液态食品内的稳定性探究

1.5单链DNA的在常见液态食品中的稳定性探究

1.6 本章小结

2无引物核酸高效扩增技术的开发与应用

2.1 引言

2.2 材料及仪器

2.3 无引物核酸高效扩增技术

2.4 无引物核酸高效扩增技术的改进

2.5本章小结

3 含特殊茎环结构核酸的扩增特性探究

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5本章小结

4 总论

4.1 结论

4.2创新点

参考文献

附录

致谢

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