产肠炎沙门氏菌外膜蛋白基因工程乳球菌的构建及性能初步研究

摘要

乳酸菌是人和动物肠道内的常见细菌,被公认为安全级(generallyrecognized as safe,GRAS)微生物。一方面它作为一种益生菌,具有维持肠道菌群微生态平衡、可激活机体粘膜免疫反应、抑制肠道内病原微生物的生长、增强动物机体免疫力等多种生物学功能。另一方面,基因工程乳酸菌在功能食品、医疗保健、人工口服疫苗等领域的应用均具有诱人的前景。
　　 禽肠炎沙门氏菌病是危害养禽业较为严重的细菌病之一,在全国各地的养殖场均有不同程度的发生,特别在集约化、高密度的养殖条件下此病造成的危害更大,沙门氏菌的外膜蛋白是较好的免疫保护性抗原,能刺激易感宿主产生细胞免疫和体液免疫反应,其中外膜蛋白OMPX作为一种毒力因子在参与细菌的粘附肠道上起重要作用,本研究根据GenBank发表的禽肠炎沙门氏菌AM933172的基因序列,采用PCR技术扩增得到外膜蛋白OMPX基因片段,并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pMG36e中,将重组质粒电转入乳酸乳球菌MG1614,成功构建了一株产肠炎沙门氏菌外膜蛋白OMPX的重组基因工程乳酸乳球菌,并对重组基因工程菌的稳定性、对小鼠的免疫保护性、耐渗透压性、对人工胃、肠液耐受性、对肉鸡的生产性能的影响等方面进行了初步研究,对工程菌的稳定性研究中,构建的基因工程乳酸乳球菌连续传代30代后,仍可检测到目的基因及目的蛋白,小鼠免疫保护性试验中发现口服基因工程菌可以为小鼠产生一定的保护性,但是效果不如蛋白免疫小鼠后产生的效果好,在耐渗透压研究中发现基因工程菌可以在盐浓度为5-6％的浓度下生长,在对人工胃、肠液的耐受性检测中发现工程菌对人工胃液及人工肠液的耐受性较好,在对肉鸡生产性能影响的研究中发现,饲喂基因工程菌对肉鸡的料肉比无影响。这为今后具有禽肠炎沙门氏菌免疫原性的基因工程微生态制剂的研制提供了一定的理论基础。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

符号说明

1 前言

1.1 乳酸菌简介

1.2 乳酸菌表达系统简介

1.2.1 组成型表达系统

1.2.2 NICE表达系统

1.3 乳酸菌表达系统存在问题及对策

1.3.1 乳酸乳球菌的培养条件

1.3.2 密码子偏好性

1.4 乳酸菌表达系统前景和展望

1.5 粘膜免疫

1.5.1 粘膜免疫简介

1.5.2 IgA与家禽粘膜免疫

1.5.3 IgA的生物学功能

1.5.4 乳酸菌粘附机制与动物机体免疫

1.6 禽肠炎沙门氏菌简介

1.6.1 危害

1.6.2 致病机理

1.6.3 外膜蛋白

1.6.4 肠炎沙门氏菌防控

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 主要试剂及培养基

2.1.3 主要实验仪器

2.1.4 动物实验中所需材料:

2.2 方法

2.2.1 细菌基因组DNA的提取

2.2.2 目的基因的PCR扩增和回收

2.2.3 pMD18-T-OMPX载体的构建

2.2.4 重组pMG36e表达载体的构建

2.2.5 重组基因工程乳酸乳球菌的构建

2.2.6 外膜蛋白OMPX的表达及SDS-PAGE分析

2.2.7 表达产物的Western blot检测

2.2.8 蛋白的粗提纯

2.2.9 小鼠攻毒剂量的确定

2.2.10小鼠免疫保护性试验

2.2.11基因工程乳酸乳球菌性能初步研究

3 结果与分析

3.1 目的基因的PCR扩增和回收

3.3 重组pMG36e表达载体的双酶切鉴定

3.4 重组基因工程乳酸乳球菌的构建

3.4.1 抗生素浓度对电转化效率的影响

3.4.2 电场强度对转化效率的影响

3.4.3 电击后细胞复苏时间对转化效率的影响

3.5 OMPX基因在MG1614中的表达及蛋白的Western blot鉴定

3.6 蛋白的粗提纯及浓度测定

3.7 小鼠攻毒剂量的确定

3.8 小鼠免疫保护性试验

3.9 基因工程乳酸乳球菌性能初步研究

3.9.1 基因工程乳球菌的稳定性分析

3.9.2 基因工程乳球菌的耐渗透压能力分析

3.9.3 基因工程乳球菌的对人工胃液的耐受性测定

3.9.4 基因工程菌对人工肠液的耐受性测定

3.9.5 基因工程乳球菌对肉鸡生产性能的影响

4 讨论

4.1 产肠炎沙门氏菌外膜蛋白基因工程乳球菌的构建

4.2 基因工程乳球菌性能初步研究

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间论文发表情况