花生中黄曲霉毒素B1臭氧降解及安全性评价

摘要

黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，具有强烈的致癌、致畸和致突变性。AFB1常污染花生及其制品，严重威胁的人类和动物的生命和健康，每年也因花生AFB1污染给生产者和加工者造成巨大的经济损失。预防或控制花生及其制品黄曲霉毒素的污染是世界性难题，早在上世纪60年代臭氧开始被应用于降解棉籽和花生粕中污染的AFB1。臭氧具有较高的活性、渗透性，并自发分解为氧气，不产生有毒有害物质，因此被广泛用于研究农产品中黄曲霉毒素的脱除。但目前还没有文献详细报道AFB1臭氧降解机理以及识别其氧化产物的结构;且大部分臭氧脱毒研究仅局限于实验室研究，尚未有配套的脱毒设备在中试以上规模生产中应用。本研究前期在模式系统下研究了AFB1的臭氧降解机理，并识别了其臭氧降解产物，后期利用自主研发的两套臭氧脱毒设备降解花生中污染的AFB1，对脱毒前后的花生进行安全性评价，为臭氧脱毒技术在食品工业中的推广应用提供重要的理论依据和技术支持。主要结果如下:
　　1、在模式系统下，随着臭氧处理时间的增加，AFB1浓度快速降低，在处理至25 s时，AFB1完全消失，并产生一些中间氧化产物，其中13种氧化产物被识别，即C17H14O10(m/z379.0667)、C17H12O9(m/z361.0554)、 C16H12O8(m/z333.0611)、C16H10O8(m/z331.0452)、C18H16O10(m/z393.0822)、C15H10O5(m/z271.0599)、C15H10O6(m/z287.0551)、C16H10O7(m/z315.0499)、C16H10O6(m/z299.0556)、C17H12O8(m/z345.0605)、C19H15NO9(m/z402.0820)、C17H12O9(m/z361.0555)、C17H12O6(m/z313.0707)。在这13种氧化产物中有6种为主要产物，即C17H14O10(m/z379.0667)、C18H16O10(m/z393.0822)、C16H10O6(m/z299.0556)、C19H15NO9(m/z402.0820)、C17H12O9(m/z361.0554)和C17H12O9(m/z361.0555)。
　　根据上述中间氧化产物，推断出AFB1臭氧降解经历两条途径:第一条是Criegee反应路径，是主要的氧化途径，由AFB1经Criegee反应产生C16H10O8(m/z331.0452)、C17H14O10(m/z379.0667)和C18H16O10(m/z393.0822);第二条苯环甲氧基反应路径，即AFB1被臭氧氧化成C16H10O7(m/z315.0502)和C15H10O6(m/z287.0551)。
　　2、根据AFB1结构与毒性的关系，确定AFB1分子左边呋喃环上的C8-C9双键以及右边的内酯环是决定AFB1毒性的主要官能团。由识别出的13种AFB1臭氧降解产物的结构判定，有9种产物呋喃环上C8-C9双键断裂或破坏，2种产物的内酯环破坏，剩余的2种产物苯环的-OCH3被-OH取代;在6种主要氧化产物中，除了氧化产物C16H10O6(m/z299.0556)呋喃上的C8-C9双键保留完好外，其它5种主要产物呋喃环上的C8-C9双键均受到破坏;与AFB1毒性相比，其绝大多数氧化产物的毒性显著降低，甚至是消失，而产物C16H10O6(m/z299.0556)仍具有一定的毒性。
　　3、干法和湿法臭氧处理均能有效降解花生中的AFB1。在相同条件下处理30h时，干法处理可将花生中的AFB1从85.83±3.36μg/kg显著降低到14.70±1.92μg/kg(P＜0.05)，脱毒率为82.88％;湿法处理可将花生中的AFB1从84.25±3.23μg/kg显著降低到8.61±0.74μg/kg(P＜0.05)，脱毒率达到89.78％。湿法脱毒效果优于干法。
　　4、采用自主研发的粮油真菌毒素脱毒设备降解花生中污染的AFB1效果显著。采用该设备对染毒花生进行处理时，在臭氧浓度50 mg/L、流速5.0 L/min条件下处理60h和120 h，花生中的AFB1含量从189.53±2.38μg/kg分别降低到20.08±0.89μg/kg和14.60±1.69μg/kg(P＜0.01)，达到GB2761-2011中对花生中AFB1含量的限量要求(20μg/kg)。
　　5、自主研发的臭氧脱毒榨油蒸炒锅脱除花生中黄曲霉毒素的工艺为:花生原始水分9～10％时，臭氧水（臭氧在水中达饱和）添加量为4～5％，臭氧浓度50 mg/L（臭氧水浓度在5.0 mg/L左右），至花生最终水分含量达到14％左右，控制浸润层温度为90℃、浸润时间20 min，蒸坯层温度为160℃、蒸坯时间40 min，炒坯层温度为160℃，炒坯时间30 min，料坯的最终温度达到110～120℃，水分含量达到2～3％时出料立即压榨制油。该工艺可将制得的花生油中AFB1含量从对照组的41.29±0.68μg/kg减少到6.09±0.28μg/kg(P＜0.01)，减少了85.25％，达到GB2761-2011对花生油中AFB1含量的限量要求(20μg/kg)。
　　6、干法或湿法臭氧脱毒时间低于40 h时，对花生蛋白、脂肪和不饱和脂肪酸含量变化的影响不显著(P＞0.05)。超过40 h时，花生中蛋白含量显著降低(P＜0.05);花生脂肪含量有减少趋势，但不显著（P＞0.05）;臭氧脱毒后花生中油酸、亚油酸、亚麻酸和花生一烯酸的含量无显著变化(P＞0.05);干法处理导致花生水分含量降低，而湿法处理会增加花生水分含量;干法处理使花生红衣颜色变深、最终变黑，而湿法处理导致花生红衣颜色变浅;臭氧处理可破坏花生红衣中的多酚类物质。
　　臭氧处理时间长于40 h会导致花生酸价(AV)和过氧化值(POV)升高。在臭氧处理40 h时，花生的AV值从对照组的0.40±0.05 mg/g显著升高到0.91±0.20 mg/g（干法）和1.72±0.21 mg/g（湿法）(P＜0.05);花生POV从0.25±0.05 mmol/kg显著升高到0.48±0.02 mmol/kg（干法）和0.52±0.07 mmol/kg（湿法）（P＜0.05），但均远低于GB16326-2005《坚果食品卫生标准》规定的限量要求(AV≤4 mg/g、POV≤6.3mmol/kg)。
　　经臭氧蒸炒脱毒后制得的花生油的亮度和透明度增加;花生油的AV和POV值虽明显升高(P＜0.01)，但远低于GB1534-2003规定的限量要求(AV≤1.0 mg/g、POV≤6.0 mmol/kg)。
　　7、臭氧脱毒后的花生贮藏稳定性表现良好。在40℃、28 d的贮存期内，臭氧脱毒后普通包装和真空包装的花生水分含量均有减少，AV和POV值虽有升高，但远低于GB16326-2005限量要求，且真空包装的贮藏效果优于普通包装。
　　8、臭氧处理能显著降低花生中AFB1的毒性，提高花生的食用安全性。染毒花生(AFB1含量189.53±2.38μg/kg)经臭氧处理60 h(AFB1含量20.08±0.89μg/kg)和120h(AFB1含量14.60±1.69μg/kg)后磨成花生糊饲喂的Wistar大鼠未见个体行为异常和中毒症状;与阳性对照组相比，饲喂臭氧处理60 h后的花生的大鼠体重增加量、食物摄入量和食物转化率都得到显著提高(P＜0.05);肝脏与肝体比显著降低;血清总蛋白(TP)和白蛋白(Alb)含量显著升高，血糖(Glu)、尿素氮(Urea)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)显著降低(P＜0.05);谷丙转氨酶(ALT)活性显著降低(P＜0.05)，总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性显著升高(P＜0.05);肝脏和肾脏切片显示除轻微的脂肪增多和空泡变性外，未见其他组织病理变化。以上指标与阴性对照组无显著差异(P＞0.05)。臭氧处理本身对大鼠无毒性作用。Ames试验和HepG2细胞毒理学试验进一步证实，臭氧处理能显著减少花生中AFB1的毒性，提高花生的食用安全性。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 黄曲霉毒素及其危害

1．2 花生及花生油中黄曲霉毒素污染

1．2．1 花生及花生油中黄曲霉毒素污染情况

1．2．2 影响花生污染黄曲霉毒素的因素

1．3 黄曲霉毒素脱除方法

1．3．1 物理法

1．3．2 化学法

1．3．3 生物法

1．4 臭氧脱除黄曲霉毒素的应用及影响因素

1．4．1 臭氧介绍

1．4．2 臭氧脱除黄曲霉毒素的应用研究

1．4．3 影响臭氧脱毒效率的因素

1．5 黄曲霉毒素臭氧化产物及安全性

1．6 研究目的和意义

1．7 主要研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 原材料

2．1．2 实验用生物

2．1．3 化学试剂

2．1．4 实验设备

2．2 方法

2．2．1 模式系统下AFB1臭氧分解产物及其路径

2．2．2 花生中AFB1的臭氧降解

2．2．3 花生臭氧处理后的安全性评价

2．2．4 臭氧脱毒蒸炒设备的设计及脱毒效果

3 结果与分析

3．1 模式系统下AFB1臭氧分解产物及分解路径

3．1．1 AFB1臭氧分解产物

3．1．2 AFB1臭氧分解产物的结构识别

3．1．3 AFB1臭氧分解路径

3．2 花生中AFB1臭氧降解效果及安全性评价

3．2．1 AFB1标品色谱图与标准曲线

3．2．2 花生中AFB1臭氧降解效果

3．2．3 臭氧处理对花生品质的影响

3．2．4 花生臭氧脱毒后的安全性评价

3．3 花生臭氧蒸炒脱毒设备的设计及脱毒效果

3．3．1 花生臭氧蒸炒脱毒设备的整体结构设计

3．3．2 蒸炒锅的结构设计

3．3．3 臭氧蒸炒脱毒工艺研究

3．3．4 花生蒸炒脱毒对花生油品质的影响

4 讨论

4．1 AFB1臭氧降解机理

4．2 花生中AFB1臭氧降解

4．3 花生中AFB1臭氧降解后的安全性

4．4 创新点

4．5 进一步研究方向

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况