Stemphylium eturmiunum asf1基因敲除突变株的构建及其生物学特性研究

摘要

新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)是一种重要的丝状真菌，该种含有交配型基因 MAT1-1和MAT1-2，是能够进行有性生殖的少数匍柄霉属真菌之一，这使其成为研究真菌有性繁殖机制和进化的良好材料。 asf1(anti-silencing function1)是进化上高度保守的组蛋白异二聚体 H3/H4 的分子伴侣，其参与依赖 DNA 复制及不依赖 DNA 复制的核小体的组装与解凝过程，同时也参与基因沉默、转录调控及DNA损伤修复等生物学过程，不同生物中asf1具有功能的保守性与多样性。组蛋白分子伴侣通过影响核小体的结构、稳定性及染色体状态，从而调控基因的表达，影响生物发育。asf1 基因在丝状真菌中的研究很少，因此我们对 S. eturmiunum 的asf1基因进行研究，探索其在匍柄霉属真菌发育过程中的作用。 本研究选取S. eturmiunum(EGS 29-099)为实验材料，该种是同宗配合的丝状子囊真菌，其可在CM培养基、25℃条件下，诱导培养进行有性繁殖，发育特性为产生黑色的子囊壳及成熟的子囊孢子。为了初步探索asf1基因对S. eturmiunum生长发育的影响，本研究构建了S. eturmiunum asf1基因的敲除突变株并结合转录组数据寻找表型与内在分子机制之间的联系。主要研究结果如下： 成功克隆及鉴定了S. eturmiunum asf1基因，并对其进行了生物信息学分析。构建了asf1基因的敲除载体，获得了asf1基因的敲除突变株（△asf1）。以野生型菌株为对照，对△asf1的生物学特性进行研究发现：△asf1完全不育；△asf1的生长速率远低于野生型的，菌丝分支较多，菌丝融合现象非常普遍；分生孢子由常规的球形或椭圆形变为无规则形状，着生方式由端生变为菌丝间生，并发育为厚垣孢子，分生孢子隔膜数变少，较多团生，单个小孢子变大，产孢梗由菌丝发育而成；△asf1菌丝的细胞核分布不均匀，某些部位较为集中。对两种菌株的转录组进行测序并分析，发现野生型菌丝体(WT)与△asf1差异表达基因为3023个；野生型有性态(SEX)与△asf1差异表达基因为3716个。野生型有性态(SEX)与△asf1、野生型菌丝体(WT)与△asf1、野生型菌丝体(WT)与野生型有性态(SEX)有380 个差异表达基因是相同的。通过对以上差异表达基因进行分析，推测190个显著上调或下调表达的基因可能参与了asf1基因调控有性发育途径，并初步界定了10个关键调控基因，说明asf1基因对其它基因的正确转录表达是必需的。 综上研究推测asf1基因通过介导组蛋白的组装与解凝对其它基因的表达进行调控， 进而对该菌的有性及无性发育产生非常重要的影响。S. eturmiunum asf1基因敲除突变株的获得及其转录组分析，为深入研究匍柄霉属真菌的有性及无性发育提供了理论与经验积累。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 匍柄霉属研究概述

1.2 真菌生殖的研究进展

1.3 asf1基因的研究进展

1.4 转录组学研究进展及应用

1.5 本研究的科学意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 asf1基因的克隆与鉴定

3.2 asf1基因的生物信息学分析

3.3 敲除载体pXEH-asf1的构建

3.3 根癌农杆菌介导的S. eturmiunum遗传转化系统的建立

3.4 S. eturmiunum的遗传转化及asf1基因敲除转化子的筛选鉴定

3.5 转化子的生物学性状分析

3.6 野生型菌株和敲除转化子的无参转录组分析

4 结论与讨论

4.1 S. eturmiunum asf1基因的克隆与鉴定

4.2 asf1基因对S. eturmiunum有性及无性发育的影响

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况