2型猪链球菌05ZYH33 sao基因敲除突变株构建及毒力研究

摘要

2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis2)是一种重要的人兽共患传染病病原体,其具体的致病机制尚不明确.为了进一步研究该基因与05ZYH33强致病性的关系,本实验室构建了sao基因敲除突变株.利用生物信息学方法对S.suis2 05ZYH33sao基因序列进行分析并设计合成引物,PCR分别扩增目的基因sao的上下游序列(均约1000 bp) LA和RA,同时从大肠杆菌—猪链球菌穿梭质粒pSET2中扩增spc抗性基因.利用扩增出的片段构建重组质粒pEASY-T1-spc. pEASY-T1-simple-LA以及pEASY-T1-simple-RA。接着通过双酶切将LA.RA片段连到pEASY-T1-spc质粒上，将重组质粒重新命名为pEASY-T1-sao。将成功构建的pEASY-T1-sao电转化入05ZYH33感受态中。分别利用PCR, TR-PCR, Western blot三种方法对疑似突变株在基因、转录、蛋白水平上进行鉴定，证实获得的阳性转化子即为05ZYH33△sao。通过细菌感染BABL/c小鼠模型对野生株和突变株进行毒力比较.结果显示与野生株相比突变株的毒力未发生明显改变。为了进一步验证其毒力是否改变，进行了菌株对Hep-2细胞的毒性实验，结果也表明sao基因敲除后并没使05ZYH33的毒性发生明显改变。由此可见sao基因并不是05ZYH33强致病性的主要因素。