解淀粉芽孢杆菌PEBA20野生株与变异株SCEV转录组分析及cheA基因突变株构建

摘要

解淀粉芽孢杆菌PEBA20是从植物中分离到的内生细菌，对多种植物病原真菌和细菌具有良好生防活性。变异株SCEV是PEBA20在单一环境持续继代培养得到的可稳定遗传的表型变异株，其生物膜表型、运动性特征以及抗菌活性都发生了明显变化。本研究对变异株SCEV和PEBA20野生株进行转录组测序分析，并利用同源重组法构建了△cheA突变株。主要研究结果如下： （1）通过RNA-seq 得到大约2.4G数据，WT（野生株）和 SCEV中分别有3825和3757个表达基因，共有2339个表达差异基因。通过KEGG富集发现TCA循环路径中存在大量基因表达差异；芽孢形成和休眠调控路径中，SCEV芽孢外壳蛋白和孢子萌发调控蛋白相关基因表达显著下调，启动芽孢形成级联反应的关键调控因子 spo0A、kinA、sigD和sigF显著上调；SCEV抗菌化合物合成的非核糖体肽及聚酮类合成路径的基因全部上调；分析与细菌群体感应相关的基因中，22个上调表达基因和12个下调表达基因，趋化性和鞭毛组装调控路径中，SCEV 共 34 个表达差异基因上调。这些基因表达差异，暗示着SCEV在芽孢形成、抗菌活性、运动特征上可能存在差异。 （2）测定了WT和SCEV运动性的差异，在0.3% LB平板上测定细菌的趋化运动能力，发现WT的趋化运动能力强于SCEV；在0.7% LB平板上测定细菌的群集运动特征，发现WT表现出明显的群集运动特征，而SCEV几乎不产生群集运动。通过同源重组技术构建了PEBA20的cheA基因突变株。通过PCR扩增cheA基因同源前臂、同源后臂和kan抗性基因片段，连接到pMUTIN4自杀载体。通过电转化分别转入PEBA20感受态细胞并通过抗生素筛选获得了cheA基因突变株。△cheA突变株在固气界面不能形成复杂的生物膜表型，生物膜表面平坦、光滑，中部塌陷，边缘略隆起且呈半透明状。在气液界面，△cheA突变株不能形成漂浮生物膜。在0.7% LB和0.3%LB平板上，△cheA突变株丧失了群集运动性和趋化运动性。

目录

声明

英文缩略词及中文对照表

1 前言

1.1芽孢杆菌与生物防治

1.2细菌运动性

1.2.1芽孢杆菌的群体感应

1.2.2芽孢杆菌的趋性运动

1.2.3细菌鞭毛与运动性

1.3转录组测序技术

1.4本研究的目的和意义

2 实验材料及方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 溶液配制

2.1.3 培养基配制

2.1.4 主要仪器

2.1.5 生化及分子生物学试剂

2.1.6 引物设计与合成

2.2 方法

2.2.1 PEBA20野生株和变异株SCEV转录组测序

2.2.2 解淀粉芽孢杆菌PEBA20 cheA基因和cheB基因突变株的构建

3 试验结果

3.1 PEBA20野生株和变异株SCEV转录组分析

3.1.1 转录组测序

3.1.2 转录组数据分析

3.2 解淀粉芽孢杆菌PEBA20 的cheA 基因突变株和cheB基因突变株构建

3.2.1 cheA基因和cheB基因同源前臂与同源后臂PCR扩增

3.2.2 Kan抗性基因的PCR扩增

3.2.3 PCR产物纯化

3.3.4 pMUTIN4质粒提取及酶切凝胶电泳检测

3.2.5 pMUTIN4-cheA和pMUTIN4-cheB重组质粒构建

3.2.6 重组质粒筛选验证

3.2.7 pMUTIN4-cheA和pMUTIN4-cheB电转化PEBA20感受态及抗生素筛选

3.2.8ΔcheA 突变株测序验证

3.2.9ΔcheA突变株固-气界面生物膜形成

3.2.10ΔcheA突变株液-气界面生物膜形成

3.2.11 cheA基因对运动性的影响

4 讨论

4.1 PEBA20野生株及变异株SCEV转录组测序及分析

4.2 解淀粉芽孢杆菌PEBA20 cheA基因突变株和cheB基因突变株构建

5 结论

参考文献

附录：

致谢

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