高发地区食管鳞癌的病因与体细胞突变图谱研究

摘要

据最新国际癌症研究署（IARC）的报告，在2012全球估计有455，800例新发食管癌病例（约占所有新发癌症的3％）和400，200例食管癌死亡病例（约占所有癌症死亡病例的5％）。作为最致命的恶性肿瘤之一，食管癌的发病率在全球呈现出显著的地理异质性，其中接近一半的新发食管癌发生在中国。食管癌按组织学分类主要有两大亚型:食管鳞癌和食管腺癌。在高发病率地区（中亚、东亚及东非地区），超过90％的食管癌属于食管鳞癌，而在北美地区食管鳞癌占食管癌的比例低于30％。
　　目前关于食管鳞癌的危险因素和基因组突变图谱研究存在如下几方面的问题:
　　1.在我国，尽管近年来食管鳞癌发病率有所降低，但其发病率和死亡率仍列各种恶性肿瘤第四位，尤其在高发地区，所导致的疾病负担更为严重。目前食管鳞癌的危险因素尚未完全明确，尤其一些潜在可调控的外源性危险因素（吸烟、饮酒、饮热茶、体重等）与食管鳞癌的患病风险存在较大争论。而一些可调控的外源性危险因素的证实，将有助于预防食管鳞癌的发生，尤其是降低高发地区的食管鳞癌的发病率。
　　2.肿瘤组织内的体细胞基因突变是肿瘤发生发展的始动因素，是癌细胞恶性化的起点，但目前在我国华东食管鳞癌高发地区，这方面的研究较少。利用外显子测序技术，能极大地提高了我们探索尚未被候选基因测序所识别的基因变异的能力，可以在全基因组水平上认识肿瘤的发生，识别外源性因素的致病机理，并且为后续肿瘤的诊断、治疗以及药物的选择提供新的靶点，
　　针对上述食管鳞癌研究存在的问题和现实研究的可行性，本论文分四个部分来探索高发地区食管鳞癌的病因与体细胞突变图谱。研究一、二和三，以人群为基础的病例对照研究设计，分别探讨了吸烟和饮酒、饮茶及其温度、体重指数(bodymass index，BMI)和Stunkard体型变化与食管鳞癌患病风险的关联。研究四在医院收集食管鳞癌手术病人的癌组织和癌旁组织，利用全外显子测序技术，初步构建食管鳞癌的体细胞突变图谱。
　　研究目的：
　　研究一 从多个维度探讨吸烟、被动吸烟和饮酒对食管鳞癌患病风险的影响，并研究吸烟与饮酒对食管鳞癌患病风险的交互作用。
　　研究二 从多个维度探讨饮绿茶，尤其温度，对食管鳞癌患病风险的影响，并且研究饮酒与饮茶在此关联中的交互作用。
　　研究三 探讨成年时身高、不同时期的BMI和Stunkard体型、个人的BMI和Stunkard体型从20岁至调查时10年前的变化对食管鳞癌患病风险的影响，同时分析性别、财富、吸烟与饮酒在此关联中的调节效应。
　　研究四 分析高发地区食管鳞癌肿瘤组织和配对癌旁正常组织的测序数据，初步构建食管鳞癌的体细胞突变图谱。
　　研究方法：
　　研究一、二和三的研究方法
　　1.在江苏省中部食管癌的高发地区——泰兴市内，建立严格的以人群为基础的病例对照研究，从2010年10月至2013年9月，在病人知道自己诊断之前，在当地四大医院胃镜室尽可能纳入所有新发的食管癌病人，同时从泰兴疾控补充当地医院没有纳入的病人，从全人群中按性别和年龄组别匹配相应的对照人群，最终符合纳入条件的，有1418例食管鳞癌病人和1992例对照。通过面对面问卷访谈收集每位研究对象的一般人口学资料、居住史、职业史、家庭和社会经济地位、个人健康状况、家族疾病史、吸烟史、饮酒史、饮茶史、10年前的饮食习惯和生育史（女性）。
　　2.主要采用非条件的logistic回归模型评估各个暴露因素的比值比(odds ratio，OR)及其95％可信区间（confidence interval，CI）。通过比较模型有无交互项进行似然比检验确定暴露因素间的交互作用。通过限制性立方样条模型评估连续性暴露因素与食管鳞癌患病风险的曲线关系。
　　研究四的研究方法
　　于2015年7至12月在泰兴人民医院，收集45例合格的食管鳞癌手术病人肿瘤组织与癌旁正常组织，提取组织的DNA进行全外显子测序，运用生物信息学方法对测序数据进行数据挖掘，筛选可用于分子分型的遗传位点，构建食管癌体细胞突变图谱。
　　研究结果：
　　1.在男性中，吸烟，特别是开始烟草暴露年龄较小时，或高强度或高累积量的烟草消耗，会一定程度地促进食管鳞癌的发生（OR约为1.50）。然而，在女性中没有发现吸烟与食管鳞癌的关联。同时，在男性或女性不吸烟者中暴露于不同的二手烟环境与食管鳞癌患病风险无显著关联。此外，在男性中，饮酒各个维度（开始饮酒年龄、饮酒年限、饮酒强度）中与食管鳞癌患病风险呈现正向的剂量反应关系（OR从1.50至2.60左右），且这一关联在当前吸烟者组中更为显著。中国女性很少饮酒，所以在女性研究人群中我们没有观察到饮酒与食管鳞癌患病风险的显著关联。
　　2.在男性中，饮用高温的绿茶与食管鳞癌的发生存在显著的相关，喝温茶，热茶和非常热的茶的OR值分别为1.29，1.47和2.15。同时，开始饮用绿茶年龄越早、饮用的年限时间越长、每天饮用的量越多与患食管鳞癌的风险呈现剂量反应关系，只有少量饮用温度较低的茶可以较弱地预防食管鳞癌的发生。此外，饮酒会明显提高饮用温度较高的绿茶对食管鳞癌的危害。
　　3.当成年男性和女性的身高分别小于170cm和157cm，身高每增加5cm，食管鳞癌的患病风险就上升约25％，之后食管鳞癌的患病风险上升趋势变得相对缓慢。尽管20岁时的BMI和Stunkard体型并没有影响食管鳞癌的发生，但10年前的BMI和Stunkard体型显示与食管癌风险呈现反向的剂量反应关系。从个体体重长期的变化趋势来看，在20岁时体重偏瘦、正常或Stunkard体型小于4的研究对象中，到10年前时体重减轻会促进食管鳞癌的发生（OR值范围从1.50到3.68），体重增加可以预防食管鳞癌的发生（OR值范围从0.18到1.02）;但是，在20岁时体重超重、肥胖或Stunkard体型大于3的研究对象中，到10年前时个体体重的变化与食管鳞癌的发生没有显著的关联。
　　4.对泰兴地区新发的45例食管鳞癌病人的癌组织与癌旁组织进行全外显子测序分析，食管鳞癌的碱基替换类型以C＞T的转换为主（接近50％），其次为T＞C的转换和C＞A的颠换;发现了5个局部超突变的基因座。有吸烟史和无吸烟史食管鳞癌患者间C＞A突变频谱比例无明显的统计学差异(P=0.525)。运用MutSigCV算法鉴定出6个可能与食管鳞癌有关的显著突变驱动基因，分别为TP53、PABPC1、FBXW4、ZNF814、CDKN2A和ANKRD20A1，另外发现54个肿瘤频发体细胞突变，主要位于ZNF717，ZNF814，FRG1，CLASRP，CTBP2，EVPL, GXYLT1, IFITM3, NBPF16, OR4C5, POU6F2, SLC9B1P1, TEKT4, TPSAB1等43个基因上，初步构建了当地食管鳞癌的外显子区域基因组突变图谱。
　　研究结论：
　　1、吸烟对食管鳞癌患病影响较弱;但饮酒与吸烟共同暴露时，会显著增加中国男性患食管鳞癌的风险，且与中国男性患食管鳞癌风险呈正向的剂量反应关系。
　　2、饮用高温的绿茶会显著增加中国男性食管鳞癌的风险，且温度上升与中国男性患食管鳞癌风险呈正向的剂量-反应关系;同时随着饮酒强度增加会显著加强高温饮茶对食管鳞癌的危害。
　　3、男性成人身高小于170cm，女性身高小于157cm，食管鳞癌的患病风险随着身高的增加而急剧上升，之后风险上升趋势缓和。在体重过轻和体重正常的人群中，个体体重减轻会促进食管鳞癌的发生，个体体重增加可以降低发生食管鳞癌的发生。但个体体重变化不能显著影响初始是超重和肥胖人群的食管鳞癌风险。
　　4、利用全外显子测序技术初步建立食管鳞癌的外显子区域体细胞突变图谱，筛选出食管鳞癌的潜在的各类遗传变异，为食管鳞癌的早期诊断和靶向临床治疗研究提供了一定的理论基础，同时从碱基突变类型的角度，进一步验证了吸烟暴露与食管鳞癌的关联总体上是不显著的。
　　研究意义：
　　上述可调控的病因危害的研究结果表明，在食管鳞癌高发区消除这些可改变的不利于健康的生活方式对于降低食管鳞癌发生具有重要现实意义。本研究初步构建食管鳞癌的体细胞突变图谱，一方面初步验证病例对照的研究结果，另一方面为未来使用大样本深入探讨食管鳞癌的危险因素与体细胞突变图谱的联系，和以食管鳞癌的体细胞突变图谱为依据开展食管鳞癌的早期诊断和临床靶向治疗研究奠定理论基础。
　　创新点：
　　1.我们建立一个较为严格的以人群为基础的病例对照研究，发现一些更有针对性的研究成果，有助于个性化的食管鳞癌病因干预。
　　2.在华东食管鳞癌高发区泰兴，初步建立食管鳞癌的体细胞突变图谱，为中国食管鳞癌的基因组突变图谱做了一定补充，为后续食管鳞癌早期诊断和靶向治疗奠定理论基础。
　　3.通过分析食管鳞癌基因组碱基突变类型与吸烟的关联，与吸烟对食管鳞癌病因流行病学的研究结果相互验证，可以更为准确地评估吸烟对食管鳞癌的效应。

目录

声明

摘要

常见缩略语说明

1．1 食管鳞癌流行病学特征

1．2 食管鳞癌基因组学研究进展

1．3 前言小结与本论文主要研究工作

第二章 吸烟、被动吸烟和饮酒对食管鳞癌患病风险的影响(研究一)

2．1 研究背景

2．2 材料与方法

2．3 研究结果

2．4 讨论

第三章 饮绿茶及其温度对食管鳞癌发病的影响(研究二)

3．1 研究背景

3．2 材料与方法

3．3 研究结果

3．4 讨论

第四章 身高、BMI和体型变化对食管鳞癌患病的影响(研究三)

4．1 研究背景

4．2 材料与方法

4．3 研究结果

4．4 讨论

第五章 高发地区食管鳞癌体细胞突变特征与基因突变图谱(研究四)

5．1 研究背景

5．2 材料与方法

5．3 研究结果

5．4 讨论

本论文研究结论

创新点与局限性

参考文献

附录

致谢

硕博连读期间完成的研究成果(2017年影响因子)

学位论文评阅及答辩情况表

附英文论文二篇