河北食管鳞癌患者中P53基因第4外显子72密码子Arg/Pro的多态性及相关发病因素研究

摘要

目的：食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，在全世界最常见的恶性肿瘤中位居第八位，其每年大约有500，000新发病例，占所有恶性肿瘤的2%。其预后五年生存率不到5%，食道癌在中国有明显的地理聚集现象，高发病率及高死亡率地区相当集中，特别是在河北磁县地区，发病率高达103.5/10万。导致食管癌发病的相关因素有很多，例如亚硝胺类化合物，霉菌毒素等。随着分子生物学的兴起，有关癌基因研究在学界成为了热点内容。众所周知，p53基因是抑癌基因，在人类半数以上的肿瘤组织均可发现p53基因的突变，而在食管癌患者中p53的突变率同样也非常高。p53蛋白的功能和结构容易收到该基因部分多态性位点影响，因此与肿瘤的易感性有关。根据目前国内外的研究情况来看，位于p53基因第四外显子控制细胞的生长抑制和凋亡，p53的N端区域包含了一个富含脯氨酸区Pro，它是p53调控的细胞凋亡、抑制肿瘤生长以及使刺瘤因子E6含量降低所必须的区域。这个区域包含5个SH3结合的PXXP模体的区域，这可能和一些信号转到途径中的因子有物理性作用。p53基因第72密码子的Arg代替Pro后去除了一个PXXP模体。这增加了p53的不稳定性，从而导致第72位密码子的多态性具有很强的连锁不平衡性。但不同民族、不同地域，其易感基因型可能不同。故本研究选用第72位密码子作为研究位点。
　　由于河北省(特别是磁县)是食管癌高发区，所以本研究旨在探讨p53第四外显子第72位密码子Arg/Pro多态性在河北地区食管鳞癌人群与正常人群分布情况比较分析，以及对食管癌患者发病的相关因素调查研究。从而为食管癌的预防及发病机理提供依据。
　　方法：
　　1基本研究方法：本实验采用病例对照研究方法
　　2标本来源：病例组：食管癌组织取自2010年11月-2011年11月期间在河北医科大学第四附属医院就诊的50例食管癌患者新发病例手术切除标本。对照组：50()自相同地区健康个体。将从病人身上取活检标本和典型部位切除下来的切片放入RNA later液中迅速冷冻。同时，还通过问卷的方式来详细获得已知的诱发食管癌的危险因素，诸如吸烟，饮酒，吸毒，饮食以及外在的暴露因素，如：木屑，工业油漆等等。在征得患者本人或其家属同意后，在无菌操作环境下取新鲜食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织。
　　3组织DNA提取：使用Qiagen tissue DNA columns来从组织中提取DNA。
　　4 P53第72密码子的多态性检测：根据第四外显子中的第72密码子的Arg/Pro核苷酸序列合成引物分别对Arg和Pro等位基因进行PCR扩增。分别利用两对引物做两管平行PCR检测两个等位基因。PCR反应在AB公司的PCR扩增仪中进行。反应体系总共为20μl，其中包括：白色体系10μl，上下游引物各1μl，去离子水7μl，DNA模版1μl。反应结束后，对扩增产物进行电泳。选择20bp DNA marker平行电泳，在紫外灯下观察扩增结果。其中Arg纯合子在约140bp处产生一个片段，Pro在约180bp处产生一个片段，杂合子Arg/Pro则分别产生上述两种片段。计算各基因型，各基因型频率用χ2检验，显著性检验水准为0.05。
　　5调查问卷：根据可能的食管癌诱发因素，分别对食管癌组及对照组制定详细的调查问卷内容，通过使用SPSS软件分析数据，从中找出食管癌发病的相关因素。其中吸烟阳性组条件为每年吸烟100支以上，饮酒阳性组为每周饮白酒100ml以上，热饮阳性组为每日饮热饮一次以上，生活环境为在某地生活10年以上。
　　结果：
　　1通过将食管鳞癌组和对照组的基因频率进行哈温均衡性检验，显示病例组与对照组的构成无明显差别。P＞0.05
　　2在河北地区食管癌患者中p53 Arg/Arg纯合子基因型的频率为20％，Arg/Pro基因型的频率为20％，Pro/Pro纯合子基因型的频率为10％，对照组上述三种基因型频率分别为，12％，52％，36％。两者相比具有显著性差异(χ2=10.607 P＜0.05)
　　3在河北地区，通过调查问卷了解50例食管鳞癌患者及50例健康对照患者进行病例-对照研究，用Logistic回归分析，在50例食管癌患者中预测有48例有食管癌，正确率96％(48/50)，在50例健康对照组中预测43例无食管癌，正确率为86％(43/50)。方程总正确率为91％(91/100)。
　　进入回归方程的自变量是“饮洒、吸烟、热饮、生活环境、家族肿瘤史”。卡方检验，χ2=98.879 P=0.000。故本方程具有统计学意义。回归方程为LogitP=-26.636+2.095生活环境+21.128饮酒+3.357吸烟+3.880热饮-1.818家族肿瘤史。
　　本例用5个高危因素的Logistic回归系数来反应5个高危因素对p/(1-p)(食管癌的发病概率对不发病的比数)的作用。饮酒对食管癌发病的比数比例为1E+0.09，吸烟为28.708，热饮为48.401，生活环境为8.128，家族肿瘤史为0.162。
　　结论：
　　1 p53基因第四外显子第72密码子Arg/Pro的多态性与河北地区人群食管鳞癌的易感性有关。
　　2河北地区食管鳞癌的高危因素为年龄、吸烟、热饮及生活环境及遗传因素。