海参α-糖苷键水解酶与海参体壁自溶相关性研究

摘要

海参营养价值丰富，然而海参的自溶现象使海参营养流失严重，即使在热加工过的海参在贮存、销售中也存在体壁劣化问题，因此寻找海参体壁自溶的影响因素成为研究热点。本文则探究海参体壁中α-糖苷键多糖水解酶（以果胶酶为重点研究对象）及其与海参体壁自溶的相关性。
　　首先比较了用于多糖水解酶活力测定的还原端基测定法，如DNS法、PAHBAH法和MBTH法，结果表明，三种方法测得的标准曲线线性关系良好，其灵敏度MBTH法最高，PAHBAH法次之，DNS法最低。由于PAHBAH法的显色产物稳定性较差，不适合酶活力的大批量测定，而DNS法灵敏度过低，因此，选择MBTH法用于海参体壁多糖水解酶活力的微量测定。
　　其次以仿刺参（Apostichopus japonicus）为实验材料，利用机械匀浆、缓冲液浸提、硫酸铵盐析、透析等分离方式从海参体壁中得到粗酶，发现具有果胶酶活力、淀粉酶活力、甘露聚糖酶活力，其中果胶酶活力最高。偏碱性条件浸提更易得到较高的果胶酶活力。以果胶为底物，研究粗酶中果胶酶的部分酶学性质，结果发现，在pH7.0时，果胶酶活性最高，在pH3.0-10.0条件下保存4hr后，果胶酶活性均略有升高，表明一定离子强度对果胶酶活力具有激活作用，且该酶耐酸碱性良好;在90℃时，果胶酶活力最高;在90℃条件下保温20min前后活力无显著性变化，说明该果胶酶耐强热，这对研究经热加工过的海参体壁在贮藏期内的体壁劣化机理具有重要意义。
　　为了对上述所得粗酶进一步纯化，通过测定粗酶液的总带电情况，发现大部分蛋白的等电点集中在pH4.40，因而选择阴离子交换柱层析，结果表明，当使用DEAE-52弱阴离子填料时，果胶酶比活较高点集中在0.1M、0.2M的低NaCl浓度交换洗脱峰中。为收集更多的果胶酶，改用Q-Fast Flow强阴离子填料，流动相pH从7.0提高至8.0，但并没有收集到更多果胶酶，表明两种方法均可用于分离果胶酶。电泳图的结果比较表明，海参体壁中的果胶酶分子量可能为280-288kDa。
　　分别研究了离子峰1(0.1M NaCl洗脱峰)和离子峰2（0.2M NaCl洗脱峰）的酶学性质，结果表明，在酶解温度为90℃和酶解pH为7.0时，离子峰1组分中果胶酶活力最高，100℃保温20min后仍具有40％的活力，Ba2+、K+对该酶有明显的激活作用，Fe3+、Mg2+、Zn2+对该酶有明显的抑制作用，Ca2+、Mn2+对该酶具有微弱的抑制作用，EDTA对可强烈抑制该酶的活性，表明该酶具备金属酶的性质。在酶解温度为80℃和酶解pH为7.0时，离子峰2组分中果胶酶活力最高，在100℃条件下保温20min，活力非降反升至原来的150％，Ba2+、Fe3+、Ca2+对离子峰2中的果胶酶有明显的激活作用，Mg2+、Mn2+、K+对该酶有明显的抑制作用，Zn2+对该酶基本没有抑制效果，EDTA可强烈抑制该酶的活性，表明该酶也具备金属酶的性质。强热使其活力非降反升的原因有待于更深入的研究。
　　最后研究海参体壁果胶酶与海参自溶的相关性，以灭过酶的海参体壁组织为底物分别以透析粗酶液、Q-Fast Folw阴离子交换洗脱酶液进行该底物的水解敏感性研究，结果表明，上述具有果胶酶活力的酶液均可使海参体壁释放还原性物质;经过强热处理的酶溶液不仅可提高果胶酶活力还可提高海参体壁还原性物质的增加速率，而并不存在蛋白酶活力，即该酶水解海参体壁的能力与果胶酶活力的增加呈正相关，而与蛋白酶活力无关。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 海参概况

1．1．1 海参的种类、分布

1．1．2 海参的生物学特性

1．1．3 海参的经济营养价值

1．2 水产动物自溶现象研究进展

1．2．1 鱼的自溶

1．2．2 虾的自溶

1．3 酶与海参自溶相关性研究进展

1．3．1 海参体壁蛋白酶

1．3．2 海参体壁多糖水解酶

1．4 多糖水解酶研究进展

1．4．1 淀粉酶

1．4．2 果胶酶

1．4．3 木聚糖酶

1．4．4 纤维素酶

1．4．5 葡聚糖酶

1．4．6 壳聚糖酶

1．4．7 甘露聚糖酶

1．4．8 琼脂糖酶

1．5 用于多糖水解酶活力测定的还原糖测定方法

1．5．1 DNS法

1．5．2 Somogyi-Nelson法

1．5．3 BCA法

1．5．4 铁氰化钾法

1．5．5 PAHBAH法

1．5．6 MBTH法

1．6 本课题的立题依据与研究意义

第二章 还原糖测定方法的建立

2．1 材料与试剂

2．1．1 主要实验材料及试剂

2．1．2 仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 溶液的配制

2．2．2 DNS法测半乳糖醛酸标准曲线

2．2．3 PAHBAH法测半乳糖醛酸标准曲线

2．2．4 MBTH法测半乳糖醛酸标准曲线

2．2．5 检测限与定量限的计算

2．3 结果与讨论

2．3．1 DNS法测半乳糖醛酸标准曲线

2．3．2 PAHBAH法和MBTH法测定还原糖标准曲线

2．3．3 PAHBAH方法的稳定性实验

2．3．4 DNS、PAHBAH、MBTH法测半乳糖醛酸的检测限和定量限

2．4 小结

第三章 海参体壁果胶酶的初步分离纯化与酶学性质研究

3．1 材料与方法

3．1．1 主要实验材料与试剂

3．1．2 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 试剂配制

3．2．2 粗酶液的制备

3．2．3 缓冲液pH对海参体壁中果胶酶浸提的影响

3．2．4 粗酶液中α-糖苷键水解酶的活力比较

3．2．5 pH对海参体壁粗酶中果胶酶活力的影响

3．2．6 温度对酶活力的影响

3．3 结果与讨论

3．3．1 缓冲液pH对海参体壁中果胶酶浸提的影响

3．3．2 粗酶液中的α-糖苷键水解酶

3．3．3 pH对粗酶中果胶酶活力的影响

3．3．4 温度对粗酶中果胶酶活力的影响

3．4 小结

第四章 海参体壁果胶酶的分离纯化方法优化

4．1 材料与试剂

4．1．1 主要实验材料与试剂

4．1．2 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 试剂配制

4．2．2 粗酶液的制备

4．2．3 粗酶液等电点测定

4．2．4 蛋白质含量测定

4．2．5 酶活力测定

4．2．6 离子交换层析

4．2．7 凝胶层析

4．2．8 电泳

4．3 结果与讨论

4．3．1 海参体壁粗酶液的等电点

4．3．2 海参体壁果胶酶离子交换层析(DEAE-52)

4．3．3 海参体壁果胶酶离子交换层析(Q-Fast Flow)

4．3．4 Q-Fast Flow与DEAE-52的比较

4．3．5 海参体壁果胶酶凝胶层析

4．3．6 离子交换层析流动相pH对洗脱组分酶组分的影响

4．4 小结

第五章 海参体壁果胶酶离子峰组分的酶学性质研究

5．1 材料与试剂

5．1．1 实验材料与试剂

5．1．2 仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 试剂配制

5．2．2 粗酶液的制备

5．2．3 蛋白质含量测定

5．2．4 酶活力测定

5．2．5 离子交换层析

5．2．6 pH对离子峰1和2组分中果胶酶活力的影响

5．2．7 温度对离子峰1和2组分中果胶酶活力的影响

5．2．8 组分离子峰1和2中的多糖水解酶活力

5．2．9 金属离子对离子峰1和2中组分中果胶酶活力的影响

5．3 结果与讨论

5．3．1 pH对离子峰1和离子峰2果胶酶活力的影响

5．3．2 温度对离子峰1和离子峰2果胶酶活力的影响

5．3．3 金属离子对组分离子峰1和离子峰2中果胶酶活力的影响

5．3．4 组分离子峰1和离子峰2中多糖水解酶的活力

5．4 小结

第六章 海参体壁果胶酶与海参体壁自溶的关系

6．1 材料与试剂

6．1．1 实验材料与试剂

6．1．2 仪器与设备

6．2 实验方法

6．2．1 试剂配制

6．2．2 底物的制备

6．2．3 酪蛋白溶液的配制

6．2．4 蛋白酶活力测定

6．2．5 多糖水解酶活力测定

6．2．6 加热酶的离子交换层析

6．3 结果与讨论

6．3．1 用离子交换层析验证海参体壁粗酶的带电情况

6．3．2 以海参体壁组织为底物测多糖水解酶活力

6．3．3 验证加热前后果胶酶活力是否存在

6．3．4 验证蛋白酶活力是否存在

6．4 小结

总结

本文创新点

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和申请专利

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