肠道病毒71型感染对小鼠CPT2、PSGL-1和SCARB2的表达和作用的影响

摘要

第一部分肠道病毒71型感染对小鼠大脑与脑干肉碱棕榈酰基转移酶2表达和作用的影响
　　目的:肉碱棕榈酰基转移酶（Carnitine palmitoyltransferase，CPT）系统在长链脂肪酸β-氧化中起着重要作用，也是线粒体脂肪酸氧化产生ATP的关键组成部分。长链脂肪酸进入线粒体的限速步骤是在线粒体外膜CPT1的催化作用下，通过转脂作用把脂肪酰辅酶A转变成酰基肉碱，并且在CPT1的作用下进入线粒体基质;在线粒体内膜CPT2把酰基肉碱转换成酰基辅酶A，然后进入β-氧化途径。在本实验中我们研究肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)感染对小鼠大脑和脑干肉碱棕榈酰基转移酶2表达和作用的影响，探讨EV71相关脑炎的病理生理机制。
　　方法:1日龄ICR小鼠8窝（48-80只），每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=107.5)的DMEM培养基0.1ml，观察小鼠感染后症状，并分别于病毒接种后5d、10d、15d各用乙醚安乐死6只感染组小鼠和6只0d（未接种病毒前）小鼠，取出大脑、脑干。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量;电子显微镜检测线粒体;应用免疫组织化学(Immune histochemical，IHC)、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、脑干CPT2的表达;检测大脑和脑干细胞的CPT2酶活性和ATP水平。
　　结果: EV71感染小鼠后5天，在大脑检测到EV71 RNA拷贝数为5.33±0.30 log10copies/mg tissue，脑干为6.20±0.19 log10 copies/mg tissue;然而，随着感染时间延长，EV71 RNA拷贝数逐渐降低。在感染后5天，电镜显示线粒体肿胀、线粒体嵴和线粒体膜断裂、变短或消失;CPT2表达下降，CPT2酶活性减低;ATP水平明显下降;而在感染后的10-15天，这些变化逐渐恢复到正常状态。
　　结论:我们的研究资料显示:EV71感染损伤了脑组织的线粒体，引起CPT2的表达减少，导致CPT2酶活性降低、ATP生成减少。能量代谢障碍可能加速或加重了EV71脑炎发展，可能与脑炎的严重程度相关。本研究从能量代谢障碍方面阐述了EV71脑炎的病理生理机制。
　　第二部分 PSGL-1在肠道病毒71型感染小鼠的表达和作用
　　目的:通过检测EV71感染小鼠不同组织中P选择素糖蛋白配体-1(Mouse P-selectinglycoprotein ligand-1，mPSGL-1)的表达，探讨P选择素糖蛋白配体-1(P-selectinglycoprotein ligand-1，PSGL-1)在EV71感染中的作用。
　　方法:1日龄ICR小鼠11窝（66-110只）随机分为2组，实验组8窝（48-80只）每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=107.5)的DMEM培养基0.1ml，另3窝(18-30只)为对照组，每只小鼠腹腔注射无菌DMEM培养基0.1ml。观察小鼠感染后症状，并分别于0d（接种病毒前）、病毒接种后、4d、8d、12d各用乙醚安乐死6只感染组小鼠与6只对照组小鼠，取出大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量;应用免疫组织化学、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏mPSGL-1的表达;应用免疫组织化学法检测CD4+、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞的表达;应用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的促炎细胞因子:肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis fector-alfa，TNF-α）、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β（Interleukin-1beta, IL-1β）含量。分析EV71感染小鼠不同组织的mPSGL-1的相对表达量对CD4+、CD8+、巨噬细胞表达的影响，以及与促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β产生水平的关系。
　　结果:EV71感染小鼠中枢神经系统的病毒载量较心脏和肺脏的病毒载量增多;mPSGL-1在EV71感染小鼠的组织中表达增加，在感染后一定时间内，mPSGL-1在中枢神经系统的相对表达量比在心脏或/和肺脏的相对表达量明显增多，尤其在脑干和大脑增多更为明显。在所被测组织中的CD4+、CD8+、巨噬细胞免疫反应染色显示也增多;另外，在EV71感染小鼠所被测组织中的mPSGL-1相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量有相关性:在感染后的4天，大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的mPSGL-1相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量成负相关;在感染后8天，除了心脏和肺脏的mPSGL-1相对表达量与TNF-α产生量未有相关性外，大脑、小脑、脑干、脊髓mPSGL-1的相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量仍成负相关;在感染后12天在所有被测组织未再有相关性。
　　结论:在EV71感染时，局部组织的mPSGL-1表达增加，可能在白细胞募集与宿主的先天性固有免疫反应中起着重要作用。
　　第三部分 SCARB2在肠道病毒71型感染小鼠的表达与促炎细胞因子的关系
　　目的:在感染性疾病时，清道夫受体(Scavenger receptor class B，member2，SCARB2)参与早期的先天性固有免疫反应;因此，本研究探讨肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)感染小鼠时，小鼠清道夫受体（mouse SCARB2，mSCARB2）在不同组织的表达和作用。
　　方法:1日龄ICR小鼠13窝（78-130只）随机分为2组，感染组10窝（60-100只）每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=1075)的DMEM培养基0.1ml，另3窝(18-30)只为对照组，每只小鼠腹腔注射无菌DMEM培养基0.1ml。观察小鼠感染后症状，并分别于病毒接种后2d、4d、6d、8d、12d各用乙醚安乐死6只感染组与对照组小鼠，取出大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量;应用免疫组织化学、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏SCARB2的表达;应用酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmuno sorbent assay, ELISA)检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的促炎细胞因子:肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis fector-alfa，TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β(Interleukin-1beta，IL-1β)含量。分析EV71感染小鼠不同组织的SCARB2相对表达量与细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量的关系。
　　结果:在EV71感染小鼠中枢神经系统的病毒载量较心脏和肺脏的病毒载量增多。在感染后一定时间段内，SCARB2在中枢神经系统的相对表达量较心脏或/和肺脏的相对表达量明显升高，尤其在脑干和大脑。另外，在EV71感染小鼠的不同组织的TNF-α、IL-6和IL-1β产生量与SCARB2相对表达量有相关性:在感染后4天、8天，大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏SCARB2的相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β含量成正相关，感染后12天未再有相关性。
　　结论:在EV71感染时，小鼠局部组织的SCARB2表达增加，可能在调节促炎细胞因子的产生中起着重要作用，尤其在中枢神经系统。