西藏当雄地区传统发酵乳制品微生物宏基因文库构建与乳酸菌生物多样性研究

摘要

宏基因组的方法能绕过某些细菌难以纯培养的障碍，可以全面客观的分析微生态环境中微生物多样性和分子生态学。中国传统发酵乳制品制作和食用已有几千年的历史，其中蕴含着丰富的微生物资源，尤其是乳酸菌，经过几千年的自然驯化，某些具有优良发酵特性的乳酸菌被保留下来。充分认识和了解这些传统乳制品中乳酸菌生物多样性，对我国传统乳制品开发利用和工业化生产具有重要意义，同时也能为生命科学研究挖掘更多的生物资源提供理论指导。 本研究运用宏基因组学思想，用CTAB—SDS—冻融法直接提取样品中微生物的总DNA，构建传统发酵乳制品细菌总DNA的16S rDNA文库，通过16S rDNA的PCR—RFLP指纹图谱分析技术，及16S rDNA全序列分析技术进行克隆文库筛选，研究西藏当雄地区传统乳制品中乳酸菌生物多样性。本实验构建了含474个阳性克隆的克隆文库，用三种限制性内切酶AluⅠ、HaeⅢ和HindⅠ酶切分析16S rDNA基因文库后，获得64种OTUs。从中选择出代表性克隆进行测序，并将序列提交美国国家生物信息中心（NCBI）进行同源性比对。分析显示，64个序列中有54个与13个纯培养菌种具有同源性，分别是德国氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp.cremoris）、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides）、开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiri）、 Acetobacter malorum、 Acetobacter fabarum、Acetobacter cerevisiae、假单胞菌属（Pseudomonas）和 Chryseobacterium vrystaatense。另外10条序列与非培养细菌的16S rDNA基因具有较高的同源性。这些研究说明该地区传统发酵乳制品存在较为丰富的乳酸菌系统发育多样性，并且有潜在的新类型的乳酸菌资源。

目录

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声明

1 引言

1.1 宏基因组学

1.2 宏基因组文库的分析技术

1.2.1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

1.2.2 限制片段长度多态性(RFLP)

1.2.3 末端标记限制片段多态性(T-RFLP)

1.2.4 单链构像多态性(SSCP)

1.2.5其他分析方法

1.3 宏基因组学研究发展现状

1.3.1 土壤微生物多样性及研究现状

1.3.2 水环境微生物多样性及研究现状

1.3.3 其它环境中微生物的多样性

1.4 本课题研究的目的和意义

2试验材料及方法

2.1 试验材料

2.1.1 发酵乳样品的采集

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 PCR扩增16S rDNA的通用引物序列

2.1.6 仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 乳样微生物总DNA的提取

2.2.2 1 6S rDNA的PCR扩增

2.2.3 PCR产物的纯化回收

2.2.4 感受态细胞的制备

2.4.5 16S rDNA文库的构建与筛选

2.2.6 质粒DNA的小量提取

2.2.7 重组质粒的鉴定

2.2.8 阳性克隆子的PCR-RFLP分析

2.2.9 测序和分析

3 结果与分析

3.1 乳样微生物总DNA的抽提

3.2 16S rDNA扩增及纯化回收

3.3 16S rRNA基因文库的构建

3.4 质粒DNA提取与检测

3.5 16S rDNA文库的筛选

3.6 序列比对及系统发育分析

4 讨论

4.1 样品总DNA提取对微生物多样性的影响

4.2 PCR扩增条件对微生物多样性的影响

4.3 克隆文库构建对微生物多样性的影响

4.4 克隆文库分析对微生物多样性的影响

5 结论

致 谢

参 考 文 献

作 者 简 介