西藏地区传统牦牛奶制品中乳酸菌的多样性研究

摘要

本研究从我国西藏自治区拉萨市2个县6个地区的不同村民家庭采集牦牛奶和牛奶样品共39份，利用传统纯培养方式结合16S rRNA基因序列分析法和非培养技术（聚丙烯酰胺凝胶电泳技术）对牦牛奶制品中蕴含的乳酸菌资源进行分离、鉴定和菌种保藏，并通过比较培养和非培养技术对牦牛奶制品中乳酸菌多样性进行综合评定。
　　牦牛奶制品中乳酸菌活菌数是利用稀释平板计数法检测，乳酸菌活菌数为6.76lg CFU/mL～9.37 lg CFU/mL，除少数样品检测结果低于107CFU/mL，大部分样品乳酸活菌数在108 CFU/mL以上，采用乳酸菌分离培养基（MRS和M17）并结合形态观察、革兰氏染色和过氧化氢实验对样品中的乳酸菌进行了分离纯化，初步获取213株乳酸菌分离株。
　　采用16S rRNA基因序列分析法对213株分离株鉴定到种水平，结果表明，所有分离株属于6个属22个不同的种和亚种，乳杆菌属（Lactobacillus）为优势菌属，占分离乳酸菌总数55.40％（118株）;其次为明串珠菌属（Leuconostoc）74株，占34.74％;链球菌属(Streptococcus)5株，占2.35％;乳球菌属（Lactococcus）8株，占3.6％;肠球菌属（Enterococcus）4株，占1.88％和魏斯氏菌属（Weissella）4株，占1.88％;从牦牛奶制品中乳酸菌的多样性角度出发，德氏乳杆菌保加利亚亚种(28.17％)和乳明串珠菌(16-43％)是西藏自治区牦牛奶制品中的优势菌种。
　　已鉴定的213株乳酸菌的16S rDNA序列上传到GenBank数据库，登录号为KF149649-KF149861。
　　利用变性梯度凝胶电泳技术研究了西藏地区具有代表性的7份牦牛奶制品中的微生物多样性;结果显示牦牛奶制品中包含了4种乳酸菌(L.bulgaricus，Lac.lactis,L.helveticus和S.thermophiles)及肠杆菌科微生物。
　　纯培养方法结合非培养技术研究牦牛奶制品中微生物多样性，其种类复杂多样，其中乳酸菌为主要参与发酵菌属，且乳杆菌是优势菌;非培养技术结果验证了纯培养中L.bulgaricus为优势菌种这一结论。

目录

声明

摘要

略缩语表

1 引言

1．1 西藏地区传统发酵牦牛奶制品

1．1．1 西藏地区传统牦牛奶制品的制作和发展历史

1．1．2 西藏地区牦牛乳资源及利用

1．1．3 传统发酵牦牛奶制品中微生物组成

1．2 乳酸菌及其益生作用

1．3 乳酸茵的分类鉴定方法

1．3．1 16S rDNA序列分析

1．3．2 变性梯度凝胶电泳技术

1．4 国内外传统发酵乳制品中乳酸菌多样性研究现状

1．5 立题意义与研究内容

1．5．1 立题意义

1．5．2 研究内容

2 传统分离鉴定方法分析乳酸菌的多样性

2．1 材料

2．1．1 样品来源

2．1．2 试验常用培养基

2．1．3 乳酸菌模式株

2．1．4 试剂

2．1．5 主要仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 乳酸菡活菌计数

2．2．3 样品中乳酸菌的分离、纯化

2．2．4 乳酸菌分离株的保存

2．2．5 乳酸菌分离株的鉴定

2．3 结果分析及讨论

2．3．1 西藏地区发酵牦牛奶中乳酸菌组成分析

2．3．2 乳酸菌的分离结果

2．3．3 乳酸菌16S rRNA基因序列鉴定结果

2．3．5 西藏地区传统发酵乳中乳酸菌的多样性

3 采用DGGE技术分析西藏地区牦牛奶制品中乳酸菌的多样性

3．1 试验材料

3．1．1 样品来源

3．1．2 主要试剂和仪器

3．2 试验方法

3．2．1 发酵牦牛奶样品中宏基因组DNA的提取及定量测定

3．2．2 16S rRNA基因V3区扩增及扩增产物检验

3．2．3 变性梯度凝胶(DGGE)电泳

3．2．4 DGGE条带的回收及测序分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 宏基因组DNA提取结果

3．3．2 1 6S rRNA基因V3区扩增结果

3．3．3 DGGE技术分析发酵牦牛奶样品中乳酸菌多样性

3．3．4 讨论

3．3．5 小结

4 结论

致谢

参考文献

附图

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