大鼠缺血再灌注损伤后皮层瘦素受体表达及ERK2、STAT3、NOS变化的研究

摘要

在遭遇急性缺血再灌注损伤时，脑组织将做出快速反应，这种反应可表现在功能、代谢及基因表达等多个水平，且大多具有代偿意义。 肥胖基因(obsese，ob，也称瘦素基因)1994年被成功克隆。随后又发现了ob基因的表达产物瘦素。动脉壁损伤后，由于肥胖大鼠体内缺乏瘦素，形成血栓的持续时间与血栓闭塞血管的时间显著延长；而在损伤前给予瘦素治疗，则可明显减轻血栓性损害的程度，使血栓形成的持续时间缩短。 一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase，NOS)依据其组织来源和诱导特性不同有三种同形体，即神经元型(neuronalNOS，nNOS)、内皮型NOS(endothelialNOS，eNOS)、诱生型NOS(inducibleNOS，iNOS)，前两种合称为固有型cNOS，主要分布血管内皮细胞、神经细胞和血小板，其催化活性依赖于细胞内Ca2+浓度，催化释放的NO量少且以脉冲形式释放，主要参与机体正常生理活动，如维持血管中等度的舒张状态，抑制血小板粘附聚集，调节白细胞趋化性和粘附，调节局部器官血流量，抑制血管平滑肌内膜下间质细胞，对神经递质传递、细胞凋亡、学习和记忆等具有重要作用。 本实验首次对大脑皮层瘦素受体表达情况及缺血再灌注损伤后瘦素受体的表达进行了研究。对缺血再灌注损伤后信号转导途径中STAT3、ERK2及NOS表达进行了探讨。 实验方法： 1、局灶性脑缺血再灌注损伤模型的制备根据ZeaLonga线栓法，并做适当改进。腹腔麻醉，切开颈部皮肤，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端。在颈总动脉近分叉处插入备用鱼线，将栓线送至大脑中动脉分叉处，平均进线18.5±0.5mm(ECA与ICA分叉处为起点)，栓线尾端留于皮肤外，栓塞1小时后抽线实现再灌注。假手术组送线长度为9mm，余步骤相同。以动物清醒后爬行时右转圈，提尾时右前肢内收屈曲为入选标准。 2、石蜡标本制备缺血再灌注相应时间过量麻醉大鼠，开胸经左心室灌入0.9％生理盐水，4％多聚甲醛溶液后，立即取脑，4％多聚甲醛溶液中后固定48h，常规乙醇梯度脱水透明，石蜡包埋，连续冠状切片，片厚7μm。 3、免疫组织化学染色标本制备按免疫组织化学SABC法进行染色，应用0.3％H2O2封闭内源性过氧化物酶活性。枸橼酸缓冲液(PH6.0)92℃热修复15分钟后，PBS洗3遍，1.5％封闭血清置湿盒孵育1小时(18～20℃)，弃去不洗，加入瘦素受体(leptinreceptor，ob-R)抗体的鼠血清(1：100，博士德)4℃孵育36小时，PBS冲洗后加生物素标记的抗羊IgG室温孵育3小时，AB复合物室温孵育2小时，DAB显色常规脱水，透明，中性树胶封片，显微镜观察。 4、电镜、免疫电镜标本制备按上述免疫组织化学染色方法进行操作后(电镜标本不做该步骤)，1％四氧化锇后固定1小时，PBS缓冲液漂洗，乙醇、丙酮梯度脱水，Epon812包埋剂包埋，LKB-2088型超薄切片机行连续切片，铀铅染色，日立H-600型透射电镜下观察。 5、半定量RT-PCR首先提取大脑皮质RNA，然后合成cDNA，后进行PCR扩增。ERK2引物序列为sense：5’GCAGGTGTTCGAGGG3’，antisense：5’GTGCAGAACATTAGCTGAAT3’，扩增片段394bp。STAT3引物序列为sense：5’TGGGTCTGGCTAGACAAT3’，antisense：5’CGTTGGTGTCACACAGAT3’，扩增片段465bp。β-actin引物序列为sense：5’GCCAACCGTGAAAAGATG3’，antisense：5’CCAGGATAGAGCCACCAAT3’，扩增片段700bp。取cDNA10μl置0.2mlEppendorf管中，分别加入5×PCRbuffer10μl、灭菌蒸馏水28.75μl、TaKaRaTaqHS0.25μl、上下游引物各0.5μl，94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环35次后72℃延伸5分钟。 6、蛋白质印迹法(Westernblot)脑缺血1小时再灌注12/24/72小时过量麻醉大鼠，迅速断头取脑，分离出顶叶皮层脑组织，立即放入液氮中保存。取大鼠皮层脑组织200mg加1ml裂解缓冲液，取25μl测蛋白含量。用酚试剂法测蛋白浓度，电泳，转印，用丽春红对固定于硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行预染，看电泳带是否清晰，证实蛋白质确实转移到膜上后。兔抗iNOS、eNOS、nNOS(1：300)抗体孵育，4℃过夜。TTBS洗两次，加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG(1：2000)室温2小时，TTBS洗两次，将滤膜放入配好的显色液中显色15～30分钟，显色清晰时，取出滤膜，用蒸馏水冲洗，取出滤膜晾干，计算机扫描，分析处理。 7、统计学分析所有数据采用SPSS11.5统计软件进行分析，数据以均值±标准差表示，采用t检验和方差分析方法。 结果： 1、大脑皮层瘦素受体的表达：瘦素受体在大脑皮层锥体细胞、血管内皮细胞、脉络丛均见表达；免疫电镜阳性反应在核膜上断续可见，在胞质内散在/集中出现，另外在线粒体边缘处亦可见到沉着。 2、与假手术对照组比较缺血再灌注24h组Ob-R表达减少(p＜0.05)；与假手术对照组比较缺血再灌注72小时组Ob-R表达明显减少(p＜0.001)；缺血再灌注72小时组与缺血再灌注24h组比较Ob-R表达减少(p＜0.05)。 3、大脑皮层神经细胞HE染色结果：假手术组大脑皮层神经细胞形态正常，无脑水肿。缺血再灌注24小时组脑皮层大部分神经细胞体积变小呈三角形，胞核浓缩深染，结构消失，血管周围间隙增宽，呈轻度脑水肿改变。缺血再灌注72小时组神经细胞坏死及水肿更为明显，神经细胞脱失，细胞周围呈扇形空泡改变，结构呈疏松化改变，周围水肿更加明显。 4、大脑皮层神经细胞电镜结果：假手术组神经细胞核膜完整，核仁清楚，细胞器结构清晰，内质网丰富可见。缺血再灌注损伤24小时组细胞膜欠规则，胞膜轻度皱缩，胞浆有较明显浓缩，核固缩及核膜改变不明显，染色质有少量聚集。缺血再灌注损伤72小时组神经细胞变性坏死，表现为神经细胞溶解，线粒体肿胀，嵴断裂，胞浆空泡化，细胞溶解不清、深染，局部板层分离，核膜皱缩，染色质出现致密团块核周边集，核固缩。 5、半定量RT-PCR：缺血再灌注12小时、24小时、72小时ERK2在大脑皮层表达增强，12小时表达开始增加，24小时达高峰，72小时表达开始减少。缺血再灌注12小时、24小时、72小时STAT3在大脑皮层表达增强，12小时表达开始增加，24小时达高峰，72小时表达开始减少。 6、蛋白质印迹法(Westernblot)：iNOS在缺血再灌注12小时、24小时、72小时与正常组比较表达明显增加，且表达在12小时开始增加，随着缺血再灌注时间的延长表达也逐渐增加；nNOS在缺血再灌注12小时、24小时与正常组比较表达明显增加，72小时与正常组比较表达无增加，且12小时表达最明显，24小时表达开始减少；eNOS在缺血再灌注12小时、24小时、72小时与正常组比较表达明显增加，且以12小时表达增加明显。即iNOS在12-72小时之间表达逐渐增加，nNOS、eNOS在12-72小时之间表达逐渐减少。 结论： 1.瘦素受体在大脑皮层锥体细胞、血管内皮细胞、脉络丛均有表达； 2.缺血再灌注损伤后瘦素受体在大脑皮层神经元表达减少； 3.缺血再灌注损伤72小时较24小时ob-R的表达减少更为明显，72小时神经元损害重于24小时；提示缺血再灌注损伤后瘦素受体的表达减少与神经元损伤的严重程度呈平行关系； 4.缺血再灌注12小时、24小时、72小时ERK2在大脑皮层表达增强，12小时表达开始增加，24小时达高峰，72小时表达开始减少； 5.缺血再灌注12小时、24小时、72小时STAT3在大脑皮层表达增强，12小时表达开始增加，24小时达高峰，72小时表达开始减少； 6、iNOS在缺血再灌注12小时、24小时、72小时与正常组比较表达明显增加，且表达在12小时开始增加，随着缺血再灌注时间的延长表达也逐渐增加；nNOS在缺血再灌注12小时、24小时与正常组比较表达明显增加，72小时与正常组比较表达无增加，且12小时表达最明显，24小时表达开始减少；eNOS在缺血再灌注12小时、24小时、72小时与正常组比较表达明显增加，且以12小时表达增加明显。

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中文论著摘要

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英文缩略语

论文一缺血再灌注损伤后大脑皮层瘦素受体的变化

论文二缺血再灌注损伤后大脑皮层ERK2、STAT3的变化

论文三缺血再灌注损伤后大脑皮层nNOS、eNOS及iNOS的表达

综 述 瘦素生物学作用的研究现状

在学期间科研成绩

致 谢

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