Ag85A DNA疫苗激活RNA传感器及其诱导的信号转导

摘要

目的:
　　自Wolff等发现裸DNA经肌肉注射可在肌细胞内表达并引入DNA疫苗概念以来，人们对DNA疫苗进行了广泛研究，取得了令人瞩目的进展。在以往广泛进行的DNA疫苗构建、接种后免疫应答（固有免疫和适应性免疫应答）或耐受，及效应产物作用机制研究基础上，虽然DNA疫苗已用于某些动物疾病的治疗，但在人类尚缺乏有效性应用。限制DNA疫苗在临床应用的主要问题是低免疫原性，接种后不能获得强有力的保护性免疫应答。为进一步探讨新的抗原提呈机制(RNA Sensors and Adaptors)，单一使用既转录mRNA又翻译Ag85A蛋白分子的Ag85ADNA质粒疫苗，尚不能证明疫苗DNA是否能通过RNA传感器从抗原提呈细胞(DC2.4)直接将抗原信息提呈给Th细胞，诱导适应性免疫应答。为此，本文进行了下面几方面的工作:
　　1:设计Ag85A突变体Ag85A-M（编码基因114位、230位碱基C突变为碱基G，分别形成TAG和TGA双重翻译终止子），以期望Ag85A既表达mRNA，又能编码抗原蛋白;突变体Ag85A-M只表达mRNA，不编码蛋白。
　　2:编码Ag85A基因突变体的人工合成，合成Ag85A DNA(891bp)全长抗原蛋白编码片段和突变体片段，并把片段克隆到增强型绿色荧光蛋白真核表达载体pIRES2-EGFP上。
　　3:构建基因组中ROSA26位点敲进Ag85A（M)基因的稳转DC2.4细胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A。
　　4:考察突变体Ag85A-M和Ag85A在稳转细胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中是否激活RNA传感器，是否存在一条RNA信号转导通路。
　　方法:
　　1:用DNAMAN8.0软件（美国Lynnon Biosoft公司开发的高度集成化的分子生物学综合应用软件，可以用于多序列比对、PCR引物设计、限制性酶切分析、质粒绘图、蛋白质分析等，几乎囊括了所有日常核酸、蛋白质序列的分析工作。）对Ag85A及突变体Ag85A-M的mRNA二级结构进行稳定性（二级结构自由能）分析。
　　2:利用普通PCR法进行人工基因合成，通过把Ag85A(mutant，M)全DNA序列分别拆分成A(332bp)、B(332bp)、C(264bp)三个小片段和D(488bp)、E(423bp)两个小片段进行分段延伸、单段PCR扩增、单段插入片段制作、单段克隆、质粒转化、检菌、质粒提取、测序、PCR扩增单段基因及PCR扩增全长基因。并把全长片段通过pIRES2-EGFP载体多克隆位点(multiple clone site，MCS)中双酶切位点EcoRⅠ/BamHⅠ插入载体，构建pIRES2-EGFP-Ag85A和pIRES2-EGFP-Ag85A-M载体，进行双酶切和基因测序，构建pET28a-Ag85A和pET28a-Ag85A-M载体，进行抗原蛋白原核表达。
　　3:采用CRISPR/Cas9技术ROSA26位点Ag85A突变基因敲进DC2.4细胞系的建立，通过共转染具有高活性sgRNA(small guide RNA)的CRISPR/Cas9质粒及含有目的基因的打靶载体pTg2.0-Ag85A(M)到DC2.4细胞系中，利用嘌呤霉素(puromycin，Puro)进行药物筛选，通过PCR方法筛选鉴定阳性单克隆细胞。
　　4:通过实时荧光定量PCR(SYBR Green qPCR)相对定量突变体Ag85A-M及Ag85A、RNA传感器RIG-Ⅰ和Mda-5（Ifih）及适配子MAVS、IRF3、IRF7和IFNβ的mRNA表达量(Fold change)，通过蛋白免疫印迹（Western Blot）电泳探讨了Ag85A及突变体抗原蛋白、RNA传感器及适配子的蛋白表达情况，通过流式细胞仪检测细胞表面因子MHCⅡ的活化程度(M2mean)。
　　结果:
　　1:编码Ag85A基因突变体的设计，原始序列全序列mRNA二级结构自由能△G=-418.30kcal/mol;突变体序列二级结构自由能△G=-416.92kcal/mol，升高了3.3‰，为1.38kcal/mol，自由能变化很小，保持了Ag85A mRNA原二级结构的稳定性。114位点碱基C突变为G（TAC→TAG），原始序列局域mRNA二级结构，TAC在圆形环上;突变序列TAG也在圆形环上，局域mRNA二级结构和一级序列都没有变化（除了TAC中的C变成了G）。230位点碱基C突变为G（TCA→TGA），原始序列TCA局域mRNA二级结构在双链与七个碱基小环交接处;突变序列TGA在双链与六个碱基小环交接处，虽然碱基发生了变化，但局域mRNA二级结构变化不大。
　　2:编码Ag85A基因突变体的人工合成，从A、B、C和D、E小片段克隆形成的菌落中分别随机挑取8个菌落进行质粒提取和测序，A、B、C阳性克隆率平均值为88％，基因保真度为90％;D、E阳性克隆率平均值为82％，基因保真度为23％。
　　获得Ag85A DNA全长片段和突变体片段。获得pIRES2-EGFP-Ag85A和pIRES2-EGFP-Ag85A-M表达载体，酶切检测和基因测序完全正确。pET28a-Ag85A表达出抗原蛋白，而pET28a-Ag85A-M不表达抗原蛋白，与实验设计一致。
　　3:采用CRISPR/Cas9技术ROSA26位点Ag85A突变基因敲进DC2.4细胞系的建立，获得目的基因序列和插入位点都正确的稳转DC2.4-Ag85A(M)细胞株。
　　4:Ag85A突变体激活RNA传感器及适配子信号转导通路，突变体Ag85A-M和Ag85A mRNA表达量与空细胞DC2.4(NC)相比具有显著性升高（P＜0.0001），Ag85A-M和Ag85A之间没有显著性差异(P＞0.05);Ag85A表达抗原蛋白，而突变体Ag85A-M不表达蛋白。RIG-ⅠmRNA表达水平在稳转细胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中与空细胞相比显著性升高（P＜0.0001），但DC-Ag85A RIG-ⅠmRNA表达量也显著性（P＜0.0001）高于DC-Ag85A-M;RIG-Ⅰ蛋白表达量都增加，DC-Ag85A增加的多一些。Mda-5mRNA在DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中表达量都显著性升高（P＜0.0001），DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中Mda-5mRNA表达量也呈显著性差异(P＜0.001);Mda-5蛋白量较空细胞都有所增加。MAVS也类似，但mRNA表达量在两个细胞系中无显著性差异。IRF3与Mda-5情况类似。IRF7情况与MAVS类似。IFNβmRNA两者都显著性增加（P＜0.0001），DC-Ag85A-M增加的多一些，DC-Ag85A-M与DC-Ag85A差异不具显著性（P＞0.05）;特异性蛋白表达都增加。细胞表面分子MHCⅡ表达量较空细胞都增加，并且具有显著性(P＜0.0001)。
　　结论:
　　1:成功自行设计和构建了Ag85A基因突变体Ag85A-M，经实验结果证明了该突变体只转录mRNA，不表达蛋白分子。此突变体中突变区域均不是双链结构，不会影响Ag85A mRNA对RNA传感器RIG-Ⅰ的活化。
　　2:本文自行设计采用Ag85A基因（全长891bp）的332bp、332bp和264bp三个片段拆分策略，利用普通PCR技术进行人工基因合成，可显著降低碱基错误率。
　　3:采用最新CRISPR/Cas9基因编辑技术于ROSA26位点成功敲进Ag85A基因突变体至DC2.4细胞系，经PCR技术鉴定获得了理想的阳性细胞克隆。
　　4:Ag85A突变体和Ag85A基因敲进的DC2.4细胞系内转录的mRNA均致RIG-Ⅰ和MDA-5的mRNA和蛋白表达水平均呈显著性升高，提示Ag85A突变体和Ag85A基因转录的mRNA诱导了二种RNA传感器的活化。
　　5:Ag85A突变体和Ag85A基因敲进的DC2.4细胞系内MAVS、IRF3和IRF7的mRNA和蛋白表达水平均呈显著性升高，提示Ag85A突变体和Ag85A基因转录的mRNA刺激RIG-Ⅰ和MDA-5活化后，很可能是通过与MAVS、IRF3和IRF7相关的转导通路，传出Ag85A突变体基因的免疫原性信号。为此，我们认为Ag85A突变体基因敲进的DC2.4细胞系内，其编码的免疫原性传出信号通路是:dsRNA(Ag85A mRNA)→RIG-Ⅰ/MDA-5→MAVS→IRF3/IRF7→IFNβ。
　　6:Ag85A突变体和Ag85A基因敲进的DC2.4细胞表面MHCⅡ与空细胞相比，反映其活化程度的M2(Mean)值显著性升高，表明MHCⅡ分子均被激活，并且具有显著性(P＜0.0001)，提示有细胞活化信号产生。
　　7:Ag85A突变体基因敲进的DC2.4细胞系内IFNβ的mRNA转录水平略高于Ag85A基因敲进的DC2.4细胞系内，提示还可能存在另外一条Ag85A转录的dsRNA信号转导通路。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1．1 实验用细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 耗材

2．2 实验方法

2．2．1 Ag85A编码基因和突变体基因

2．2．2 Ag85A及突变体Ag85A-M的mRNA二级结构分析

2．2．3 全基因合成技术路线

2．2．4 拆分小片段策略

2．2．5 引物的溶解

2．2．6 分段延伸

2．2．7 单段PCR扩增

2．2．8 单段插入片段(Insert)制作

2．2．9 单段克隆

2．2．10 PCR扩增单段基因

2．2．11 PCR扩增全长基因

2．2．12 全长片段加A

2．2．13 全长克隆测序、双酶切

2．2．14 细胞复苏

2．2．15 细胞培养

2．2．16 细胞基因组DNA的提取

2．2．17 DC2．4细胞系的质粒转染

2．2．18 细胞系构建流程

2．2．19 CRISPR／Cas9技术ROSA26位点基因敲进Ag85A(M)技术路线

2．2．20 打靶策略

2．2．21 引物设计

2．2．22 PCR反应条件

2．2．23 定量PCR引物设计

2．2．24 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)

2．2．25 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2．2．26 蛋白免疫印迹(Western blot)

2．2．27 流式细胞术

2．2．28 统计学结果分析

3 结果

3．1 DC2．4细胞系的质粒转染

3．2 编码Ag85A基因突变体的设计分析

3．3 编码Ag85A基因突变体的人工合成

3．3．1 A、B、C、D和E片段合成

3．3．3 pIRES2-EGFP-Ag85A(M)载体EcoR I／BamH Ⅰ双酶切

3．3．4 三片段拆分法与两片段拆分法合成效率

3．3．5 pET28a-Ag85A(M)原核表达

3．4 采用CRISPR／Cas9技术ROSA26位点Ag85A突变基因敲进DC2．4 细胞系的建立

3．4．1 对ROSA26位点靶序列的PCR鉴定

3．4．2 Cas9／sgRNA的活性检测

3．4．3 打靶载体构建

3．4．4 打靶载体图谱

3．4．5 打靶质粒酶切鉴定

3．4．6 PCR法阳性单克隆鉴定

3．4．7 插入位点检测

3．5 Ag85A编码基因及突变体基因表达

3．6 RNA传感器及适配子的表达水平检测

3．6．2 黑色素瘤分化相关基因5(Mda-5)的表达水平

3．6．3 线粒体抗病毒信号转导蛋白(MAVS)的表达水平

3．6．4 干扰素调节因子3(IRF3)的表达水平

3．6．5 干扰素调节因子7(IRF7)的表达水平

3．6．6 Ⅰ型干扰素β(IFNβ)的表达水平

3．6．7 主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)的表达水平

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 RNA传感器RLRs家族研究新进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历