口服Ag85A DNA疫苗诱导肠道LPL亚群及其生物学活性的变化

摘要

目的:Ag85A是Ag85家族成员之一，存在于结核杆菌和BCG等分枝杆菌的细胞壁及培养滤液中，在该家族中所占比例最大，是十分重要的免疫保护性抗原。目前大量研究显示DNA疫苗具有实际效果和广阔的应用前景，此种革命性技术已被证明在动物模型中有效，并且已批准一些DNA疫苗产品用于兽医领域。由于其多功能性、安全性和简单性，这些疫苗可以靶向更广泛的生物体，并将显示出其潜在的优势。DNA疫苗可采用多种方式接种，经多种途径如粘膜、皮肤和肌肉等诱导适应性和固有性免疫应答。依据所含目的基因及表达产物的不同可导致机体免疫应答上调或下调，产生不同类型的免疫应答。而在诸多接种方式中，口服为最简便，最易被接受的方式。为此，我们采用灌胃的方式给予正常小鼠自制的Ag85A DNA疫苗，疫苗1（含正常Ag85A基因，既能转录mRNA，又能转译成蛋白分子）和疫苗2（含突变Ag85A基因，能转录mRNA，不能转译成蛋白分子），观察肠道局部的免疫应答，对其诱导的LPL亚群及生物学功能变化进行探究，并对肠道中的抗原提呈机制进行初步探讨，以便为设计免疫原性较强的DNA疫苗提供实验和理论依据。
　　研究方法:1、DNA疫苗的制备:将本研究组自制的piRES2-EGFP-Ag85A质粒（含正常Ag85A基因，既能转录mRNA，又能转译成蛋白分子）和piRES2-EGFP-Ag85A(M)质粒（含突变Ag85A基因，能转录mRNA，不能转译成蛋白分子）分别与LipofectaminTM2000脂质体（100ug质粒/100ul脂质体）混合包裹制成DNA疫苗，分别称为疫苗1和疫苗2，并采用相同方法将piRES2-EGFP空质粒与LipofectaminTM2000脂质体包裹，命名为空质粒，用于对照。2、免疫小鼠:将C57BL/6小鼠随机分为5组，生理盐水组，脂质体组，空质粒组，疫苗1组和疫苗2组，每组4只。分别灌胃接种生理盐水，脂质体，空质粒，疫苗1，疫苗2，每次间隔14天，共3次。3、检测小鼠经疫苗接种后免疫功能的变化:采用ELISA法检测固有层淋巴细胞培养上清中细胞因子的分泌水平;采用Real-time PCR法检测肠粘膜组织内细胞因子表达水平;采用流式细胞术检测固有层淋巴细胞中T细胞亚群的比例变化。
　　结果:1、piRES2-EGFP-Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠Th1型免疫应答。疫苗1与疫苗2均可促进LPL分泌IFN-γ，而IL-4的分泌水平无明显差异。疫苗1与疫苗2均可促进肠粘膜组织内IFN-γ和IL-2表达、抑制TGF-β的表达，而IL-4的表达水平无明显差异。2、piRES2-EGFP-Ag85A DNA疫苗可改变小鼠LPL亚群数量和比例。疫苗1与疫苗2均可促进LPL内CD4+T细胞和CD8αβ T细胞数量与比例升高，而致CD8+T细胞，CD8ααT细胞和TCRγδ细胞数量与比例下降。
　　结论:1、疫苗1与疫苗2均可诱导正常小鼠的Th1型免疫应答。2、疫苗2可能通过非经典方式（指MHC-肽复合物方式）传递Ag85A免疫原信息给T细胞。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 Ag85A DN^疫苗的制备

2．2．2 实验小鼠的接种

2．2．3小肠固有层淋巴细胞的提取

2．2．4 LPL中T细胞亚群的检测

2．2．5 LPL中细胞因子分泌水平的检测

2．2．6 肠粘膜组织内细胞因子mRNA表达水平的检测

3．1 LPL中T细胞亚群的检测

3．1．1 CD3+CD4+LPL和CD3+CD8+LPL亚群的检测结果

3．1．2 CD8αα+LPL和CD8αβ+LPL亚群的检测结果

3．1．3 TCRαβ+LPL和TCRγδ+LPL亚群的检测结果

3．2 LPL中细胞因子水平的检测

3．3 小肠组织细胞因子mRNA表达水平的检测

4 讨论

5 结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述 肠上皮内淋巴细胞研究新进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历