胚胎小体制备新方法的建立及小鼠胚胎干细胞体外分化形成新生血管的实验研究

摘要

本实验通过采用先贴壁培养胚胎干细胞3d，再悬浮培养的策略，探讨建立一种制备胚胎小体的新方法。此外，通过在体外建立小鼠胚胎干细胞二维和三维分化体系，探讨小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化并形成新生血管的条件及特点，为进一步研究血管发育机制奠定基础。 研究方法： 1.细胞培养制备原代小鼠胚胎成纤维细胞(primarymouseembryonicfibroblast,PMEF)，冻存后备用。小鼠ES细胞株R1培养于经10μg/mL丝裂霉素C(mitomycinC，MMC)处理2h的饲养层细胞STO(小鼠胚胎成纤维细胞株)及PMEF上。当ES细胞生长至亚融合状态时进行传代，每天换液以维持其未分化状态。 2.贴壁法制备EBs当ES细胞R1生长至70﹪～80﹪亚融合时，将其消化成单个细胞，以1×106的细胞数接种到100mm组织培养皿中，用含低浓度LIF(1ng/mL)的ES细胞培养液连续贴壁培养3d后，收集贴壁细胞团，继续在EBs培养液中悬浮培养。 3.EBs形态学观察相差显微镜下观察不同发育阶段该方法得到的悬浮生长EBs的形态学特点；收集不同阶段的EBs行冰冻切片，观察EBs内部结构特点。 4.EBs分化能力测定分别对悬浮培养EBs的冰冻切片及贴壁分化EBs的细胞爬片行三个胚层标志物的免疫荧光染色，包括内胚层标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)，中胚层标志物血小板内皮细胞粘附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1,PECAM-1)以及外胚层标志物神经丝蛋白68KD(neurofilament68KD，NF-68)，观察两种分化状态下三胚层标志物的表达情况。 5.二维分化体系中ECs分化及血管形成情况的观察二维分化体系的建立：生长至第5d的EBs置于0.1﹪明胶包被的盖玻片上培养使其贴壁分化；对贴壁分化的细胞行Dil-Ac-LDL标记及PECAM-1免疫荧光染色，观察ECs分化及血管形成情况。 6.三维分化体系中ECs分化及血管形成情况的观察三维分化体系的建立：包括悬浮培养的EBs体系及三维Ⅰ型胶原培养体系。前者是将EBs一直悬浮培养，后者是将EBs在含有生长因子混合物的培养基中连续培养11d，然后接种到1mg/mL的Ⅰ型胶原中；将悬浮培养的EBs体系中的EBs行冰冻切片，PECAM-1免疫荧光染色后用激光共聚焦显微镜行图像三维重构，观察形成血管的三维结构。倒置相差显微镜下观察Ⅰ型胶原培养体系中的细胞EBs出芽情况。 研究结果： 1.ES细胞形态特征ES细胞在STO及PMEF饲养层上均保持未分化状态，形成致密的细胞集落，集落边缘光滑，内部看不清细胞边界。但二者也有差别，在STO上，ES细胞生长较慢，以圆形集落为主；在PMEF上，ES细胞生长迅速，以椭圆形集落为主。 2.EBs的形成贴壁培养3d后，可见大量EBs形成，形成率40﹪左右，EBs大小均一，EBs周围可见部分内胚层细胞分化。 3.EBs各发育阶段的形态结构EBs经悬浮培养后迅速分化，1d～2d后可形成典型的简单EBs(simpleembryoidbodies，SEBs)，随培养时间延长，SEBs进一步分化形成成熟囊性EBs(cysticembryoidbodies，CEBs)，CEBs具有类似早期胚胎的原始内胚层、基底膜、柱状原始外胚层及囊腔等结构。 4.EBs具有分化为三个胚层来源细胞的能力无论是悬浮培养EBs的冰冻切片还是贴壁分化EBs的细胞爬片，其三胚层标志物AFP、PECAM-1及NF-68免疫荧光染色结果均为阳性，说明应用本方法所获EBs具有较完全的分化能力。 5.二维分化体系中ECs分化及血管形成情况在二维分化体系，ES细胞在无外源性生长因子存在的条件下可自发向ECs分化，ECs主要定位在分化细胞密集处，分化表现为三种形式：ECs呈集落样生长，不形成网状结构；ECs互相连接形成仅在荧光显微镜下可以识别的网状结构；ECs互相连接形成在相差显微镜和荧光显微镜下均可识别的网状结构。在二维分化体系中，相差显微镜下还可见到三种其他形态的网状结构，经PECAM-l免疫荧光染色证实并非ECs网，说明并非所有光镜下可见的网状结构均为ECs网。 6.三维分化体系中ECs分化及血管形成情况在三维的悬浮EBs培养体系，ECs的分化不依赖于外源性生长因子，分化表现为条索状结构、管腔样结构及排列紊乱的细胞团三种形式。对该EBs的冰冻切片进行的三维图像重构显示，EBs中有大量的血管网形成。在三维的Ⅰ型胶原培养体系中，ES形成的EBs表现为出芽式血管新生，这一过程依赖于外源性生长因子混合物。 研究结论： 1.本实验成功建立了一种制备EBs的新方法，与目前常用的EBs制备方法相比，本法操作简便，EBs形成率高、分化阶段同步、结构典型，具有分化为三个胚层来源细胞的能力。因此该方法可作为胚胎早期发育和ES细胞分化等研究的理想工具。 2.本实验表明，在体外建立的二维和三维ES细胞分化体系中，ECs分化及新生血管形成过程与体内相似，表现为血管生成和血管新生两种形式，为进一步研究血管发育机制奠定了基础。

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摘要

前言

第一部分利用胚胎干细胞建立贴壁制备胚胎小体的新方法

第二部分小鼠胚胎干细胞体外分化形成新生血管的实验研究

结论

致谢

参考文献

综述 小鼠胚胎干细胞及胚胎小体在血管发育研究中的应用