渗透压补偿性溶质ECTOINE对酶稳定性影响的研究

摘要

环形氨基酸Ectoine(1，4，5，6—四氢—2—甲基—4—嘧啶羧酸)是由嗜盐菌在高渗透压诱导下合成的一种具有两性离子特性的渗透压补偿性溶质，对蛋白质、核酸、细胞等在逆环境下具有保护作用。本论文以植酸酶和脂肪酶为酶蛋白，从发酵制备、对酶的保护应用和作用机理等方面对Ectoine进行了研究。
　　 从盐池淤泥中筛选了一株中度嗜盐菌B2。细胞抽提物中经1H—NMR鉴定含有Ectoine。菌株经16S rDNA鉴定属于盐单胞菌属(Halomonas sp．)。在含2 mol/L NaCl的谷氨酸单钠培养基中发酵合成Ectoine最大量达到3．5g/。
　　 通过与其他补偿性溶质比较，考察了Ectoine对植酸酶(PHYAⅡ)的热稳定性保护作用。研究了Ectoine的添加量、保护方式及对PHYAⅡ高温水解的影响。实验结果表明，Ectoine作为PHYAⅡ的热稳定性保护剂，用量最少，保护作用好。
　　 利用PHYAⅡ失活热力学和动力学分析，结合紫外和荧光光谱技术，推测Ectoine提高了酶热稳定性的作用机理。结果表明，Ectoine可以提高酶分子△U*、△H*、△G*和t1/2，降低失活速率常数k；荧光、紫外吸收光谱表明Ectoine对酶热处理后的肽链伸展不利。因此推测Ectoine的添加主要导致酶内部或酶与外界水介质的氢键发生变化，从而有利于酶热稳定性增加。
　　 以转酯合成生物柴油和酯化合成油酸乙酯为反应体系，考察Ectoine对Novozym435和Aspergillus oryzae DM—01全细胞脂肪酶在有机相中酶活性的影响。结果表明，作为底物的甲醇和乙醇在一定浓度下对脂肪酶具有抑制作用。添加适量Ectoine，在脂肪酶一次或反复使用中，均对脂肪酶有显著保护作用。和同质量的其他补偿性溶质比较，Ectoine保护效果最好。添加过量Ectoine则会抑制酶活性。
　　 利用傅立叶变换红外光谱技术(FTIR)，结合酶催化动力学分析，探讨Ectoine提高脂肪酶在甲(乙)醇和油酸中活性的保护机理。对Novozym435的红外原始图谱和二级结构分析表明，适量Ectoine会降低甲醇对酶的氢键缔合作用，通过增加β—折叠结构来提高酶稳定性，酶催化动力学也表明适量Ectoine会减小甲醇对酶的亲和力。对A．oryzae DM—01脂肪酶红外光谱分析表明，油酸和无水乙醇都对酶构象有影响，其中油酸使酶的分子内氢键明显减弱，对酶构象影响较大。添加Ectoine，使酶的二级结构含量变化趋势减小，会更接近自然状态的酶。

目录

文摘

英文文摘

创新点摘要

引言

第1章 文献综述

1.1 酶稳定性

1.1.1 影响酶稳定性的环境因素

1.1.2 酶稳定性研究方法

1.1.3 提高酶稳定性策略

1.2 酶稳定剂

1.2.1 酶稳定剂种类

1.2.2 渗透压补偿性溶质的种类及性质

1.2.3 渗透压补偿性溶质Ectoine

1.2.4 Ectoine对酶的保护作用机理

1.3 植酸酶和脂肪酶的稳定性

1.4 本论文研究背景和内容

第2章 中度嗜盐菌Halomonas sp.B2发酵制备Ectoine

2.1 主要材料

2.1.1 样品来源

2.1.2 培养基

2.1.3 材料

2.1.4 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的分离纯化及分类鉴定

2.2.2 摇瓶培养

2.2.3 Ectoine浓度的HPLC测定

2.2.4 Ectoine的1H-NMR鉴定

2.2.5 发酵罐分批发酵

2.2.6 细胞干重测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 Ectoine合成菌株的分离筛选

2.3.2 Ectoine的1H-NMR鉴定

2.3.3 NaCl浓度对Ectoine合成的影响

2.3.4 Ectoine分批发酵

2.4 小结

第3章 Ectoine对植酸酶热稳定性影响的研究

3.1 实验材料

3.1.1 实验菌株

3.1.2 材料

3.1.3 试剂配制

3.1.4 仪器设备

3.2 实验方法

3.2.1 植酸酶纯化

3.2.2 植酸酶活性测定

3.2.3 残余酶活性测定

3.2.4 植酸水解率测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 PHYAⅡ热稳定性

3.3.2 Ectoine对PHYAⅡ热稳定性的影响

3.3.3 Ectoine对PHYAⅡ水解的影响

3.3.4 Ectoine对PHYAⅡ热稳定性保护作用方式

3.3.5 Ectoine与其它补偿性溶质对PHYAⅡ热稳定性影响比较

3.4 小结

第4章 Ectoine提高植酸酶热稳定性机理的研究

4.1 实验材料

4.1.1 材料

4.1.2 仪器设备

4.2 实验方法

4.2.1 PHYAⅡ失活动力学分析

4.2.2 PHYAⅡ失活热力学分析

4.2.3 植酸酶热失活测定

4.2.4 PHYAⅡ紫外和荧光光谱扫描

4.3 结果与讨论

4.3.1 植酸酶热失活的动力学分析

4.3.2 植酸酶热失活的热力学分析

4.3.3 热处理下植酸酶构象分析

4.4 小结

第5章 Ectoine在有机相对脂肪酶保护作用的研究

5.1 实验材料

5.1.1 实验菌株

5.1.2 材料

5.1.3 培养基

5.1.4 仪器设备

5.2 实验方法

5.2.1 Novozym435催化转酯合成生物柴油(脂肪酸甲酯,ME)

5.2.2 气相色谱分析

5.2.3 全细胞脂肪酶的制备

5.2.4 油酸乙酯合成

5.2.5 油酸乙酯酯化率的测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 Ectoine对Novozym435催化转酯合成生物柴油的影响

5.3.2 Ectoine对DM-01脂肪酶催化酯化合成油酸乙酯的影响

5.4 小结

第6章 Ectoine对有机相脂肪酶保护作用机理探讨

6.1 实验材料

6.1.1 材料

6.1.2 仪器设备

6.2 实验方法

6.2.1 反应初速率动力学模型的建立

6.2.2 Novozym435红外测试方法

6.2.3 红外光谱数据处理

6.2.4 DM-01脂肪酶的制备提取

6.2.5 Ectoine对乙醇中脂肪酶紫外光谱的影响

6.2.6 DM-01脂肪酶红外测试方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 酶促棉籽油转酯反应中外扩散限制的影响

6.3.2 Ectoine对酶促动力学影响

6.3.3.Eetoine对Novozym435构象影响的研究

6.3.4 Eetoine对Novozym435蛋白质酰胺Ⅰ带二级结构的影响

6.3.5 Ectoine对DM-01脂肪酶在无水乙醇中构象的影响

6.3.6 Ectoine对油酸环境中DM-01脂肪酶的构象的影响

6.4 小结

结论

参考文献

附录 A Ectoine对Novozym435 FTIR光谱影响

附录 B Ectoine对DM-01脂肪酶FTIR光谱的影响

攻读学位期间公开发表论文

致谢