牛乳中α-乳白蛋白的表位定位研究

摘要

乳及乳制品因其丰富的营养而深受人们的喜爱,但同时,乳及乳制品又是一类常见的食物过敏原。牛乳过敏严重影响着部分人群的健康和生活质量,流行病学调查显示,2％-2.5％的婴幼儿和1％左右的成人对牛乳过敏。因此,开展牛乳过敏的研究具有重要的理论和现实意义。
　　 牛乳α-乳白蛋白属于溶菌酶家族,是导致牛乳过敏的主要过敏原蛋白之一。本研究主要包括牛乳α-乳白蛋白的分离纯化,兔抗牛乳α-乳白蛋白多克隆抗体的制备、多克隆抗体的纯化及牛乳α-乳白蛋白的线性及构象型表位的定位。研究的主要结果及结论如下。
　　 1.采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析及Sephadex G-75凝胶层析从牛乳中分离纯化α-乳白蛋白,SDS-PAGE鉴定结果表明,分离得到了纯度达90％以上的牛乳α-乳白蛋白,回收率为19.42％
　　 2.以纯化得到的牛乳α-乳白蛋白免疫日本大白耳兔,制备了兔抗牛乳α-乳白蛋白多克隆抗体,间接ELISA检测结果表明,两只兔子所获血清效价分别达1:204,800和1:320,000,抗血清与牛乳中其它蛋白无免疫交叉反应,特异性较好。但Western blotting结果却显示与不同来源的α-乳白蛋白能发生不同程度的免疫交叉反应。
　　 3.利用溴化氰活化的Sepharose4B柱材偶联牛乳α-乳白蛋白对所获抗血清进行亲和纯化,以3M MgCl2为洗脱液对抗体进行特异性洗脱,浓缩后得到SDS-PAGE纯的兔抗牛乳α-乳白蛋白IgG抗体,间接ELISA结果表明抗体效价回收良好。
　　 4.以纯化后的特异性兔IgG为靶分子,用噬菌体随机七肽库及噬菌体随机环七肽库对其进行淘选,经过4轮的淘选后,随机挑选未扩增的噬菌体克隆进行ELISA鉴定,提取阳性克隆DNA,进行测序、分析得到模拟肽序列。随机七肽库筛选后的模拟肽经Clustalx软件比对得到牛乳α-乳白蛋白与兔IgG结合的线性表位区为AA21-27,AA36-41,AA63-68,AA79-82,AA114-119。借助生物信息学手段,比对随机环七肽库筛选到的模拟肽,得到2个牛乳α-乳白蛋白与兔IgG结合的构象型表位区,分别定位在T33 S34 Q39 A40 Q54及D46 S47 N56D63 D64 Q65 N66 P67 H68 S69 S70 N71。