牛乳β-乳球蛋白构象性表位定位及结构特征研究

摘要

牛乳过敏是严重食物过敏之一,其中在1岁新生儿的发生率可以达到2.2％到2.8%。牛乳中含有20多种蛋白,其中β-乳球蛋白是牛乳中主要过敏原之一,约82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。另外,过敏原表位包括线性和构象性表位,它们是过敏反应的物质基础。相对于线性表位,人们对构象性表位的认知严重不足。毫无疑问,牛乳β-乳球蛋白构象性表位的研究具有重要意义。
　　 本论文工作包括抗牛乳β-乳球蛋白特异性IgE的纯化,噬菌体展示技术淘选特异性模拟肽,生物信息学模拟构象性表位、构象性表位氨基酸的结构特征。研究的主要方法结果及结论如下:
　　 1.以牛乳过敏患者的血清为样品,通过Sepharose 4B亲和柱和Protein G亲和柱,逐步纯化患者血清中特异性IgE抗体,建立了两步法纯化抗牛乳β-乳球蛋白特异性IgE的方法。选择ELISA法检测纯化后IgE的纯度,所得特异性抗体纯度较高,而ELISA结果同时显示IgE抗体经纯化后仍然保持了与牛乳β-乳球蛋白较高的结合能力。
　　 2.采用亲和淘选的方式,以纯化的抗牛乳β-乳球蛋白特异性IgE为靶分子,经过3轮淘选,随机挑选32个克隆子,进行测序鉴定,得到了三个模拟肽的核苷酸序列,推导的相应氨基酸序列为DYSEHKE,TIPGQGP,NQKLSNL。
　　 3.将牛乳β-乳球蛋白的结构和模拟肽序列输入到网络服务器Pepitope中,通过比对模拟肽的参数,成功地将模拟肽转换成了牛乳β-乳球蛋白的3个构象性表位,它们分别是A:Leu87-Asn88-Asn90-Lys91-Glu108-Ser110,B:Ile2-The4-Pro113-Gin115-Pro144和C:Thr18-Tyr20-Glu44-Glu45-Lys47-Glu55-Glu157,其可信度依次为A＞B＞C。
　　 4.利用生物信息学软件DNAStar以及SOPMA网络服务器,分析了3个牛乳β-乳球蛋白构象性表位氨基酸结构特征,它们主要是极性氨基酸。与预测的牛乳β-乳球蛋白的亲水性、表面可及性以及抗原性对照,发现3个构象性表位的18个氨基酸中,4个氨基酸处于亲水性区域中,2个位于表面可及性区域中,7个在抗原性区域中。与预测的牛乳β-乳球蛋白二级结构为参照,构象性表位氨基酸所在的的区域分布为:α-螺旋7个氨基酸,折叠区域6个氨基酸,无规则卷曲区域5个氨基酸。但通过模拟肽在牛乳β-乳球蛋白三维结构中定位出的3个构象性表位,它们分布则为:折叠区域有8个氨基酸,转角区域有2个氨基酸,无规则卷曲区域有8个氨基酸。