聚乙二醇修饰对牛乳β-乳球蛋白的致敏性与构象变化的研究

摘要

聚乙二醇修饰技术(PEGylation)是20世纪七十年代中后期发展起来的一项新技术,通过修饰可以使蛋白药物的抗原性降低或消除、增加水溶性、提高稳定性等一系列优点。本课题研究了PEG修饰对β-乳球蛋白致敏性和构象变化的影响,初步探讨了β-乳球蛋白致敏性与构象变化之间的关系。
　　 导致牛乳过敏的主要过敏原之一为β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg),消除主要致敏原β-乳球蛋白的致敏性始终是国内外乳制品加工技术研究的热点之一。本文以mPEG-SC(20kDa)修饰β-乳球蛋白,通过间接竞争ELISA研究修饰产物抗原性的变化,结果表明:修饰反应时间对β-Lg抗原性降低的效果影响最大,最佳反应条件即修饰反应溶液pH7.0、反应时间8h、mPEG-SC与β-Lg物质的量比3:1时的抗原性为53.64μg/mL(初始值为180μg/mL),抗原性降低率为70.20％;SDS-PAGE得到PEG修饰β-Lg的产物有两种:两点修饰产物(di-PEGylatedβ-Lg,58 kDa)和三点修饰产物(tri-PEGylatedβ-Lg,78 kDa)。通过阳离子交换层析法(树脂为SP Sepharose Fast Flow)分离纯化PEG修饰β-乳球蛋白后的产物,收集洗脱峰。经SDS-PAGE实验得到纯化的产物为两点修饰产物、三点修饰产物。修饰产物的荧光光谱实验结果表明,PEGylation过程中发生荧光淬灭的现象,导致β-Lg的三、四级结构发生了变化,同时β-Lg抗原性的降低伴随着相对荧光强度的降低。圆二色谱分析结果表明,PEGylation过程中,从β-Lg到di-PEGylatedβ-Lg,再到tri-PEGylatedβ-Lg,β-sheet含量逐渐增加(β-sheet含量:β-Lg33.2%,di-PEGylatedβ-Lg35.7%,tri-PEGylatedβ-Lg44.6%);随着结合到β-Lg分子上PEG分子的增加,α-helix从14.3%到14.9%,再到19.2%,表明α-helix略有增加。
　　 总之,由构象研究可以说明PEG修饰β-Lg后会使β-Lg构象表位发生变化,导致致敏性发生降低,即PEG修饰β-Lg后可以掩盖βLg的抗原决定簇,使蛋白质免疫原性和抗原性产生降低。