TIM-1信号通路在IgA肾病小鼠发病机制中的作用

摘要

目的：
　　建立IgA肾病小鼠模型来明确IgA肾病小鼠肾脏组织中TIM-1的表达，及对 IgA肾病小鼠肾脏病理损害的影响，以及对 IgA肾病小鼠 Th1、Th2、TLR4信号通路的影响，初步探索在IgAN发病机制中TIM-1信号通路的作用。
　　方法：
　　挑选36只雄性SPF级BALB/c小鼠来构建IgA肾病模型。分为正常对照组、正常对照组+anti-TIM1组、IgAN模型组、IgAN模型组+anti-TIM1组。Anti-TIM1每周一次腹腔注射100ug，持续7周。实验期间主要研究以下几点：1、各组小鼠一般情况的差异；2、通过肾脏病理切片，鉴定 IgAN模型是否成功；3、采用Westernblot法测各组小鼠肾脏TLR4、MyD88、NF-κB、IFN-γ、IL-4、TIM-1的表达；4、半定量 RT-PCR及免疫组化技术检测TLR4、MyD88、NF-κB、IFN-γ、IL-4、TIM1在四组小鼠肾脏组织上的表达情况；5.对 IgAN模型组、IgAN+anti-TIM1组的TIM-1表达与IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4比值及肾脏病理指标进行Pearson相关性分析。
　　结果：
　　1.本研究中正常对照+anti-TIM-1组、IgAN模型组和IgAN+anti-TIM-组小鼠体重增长量小于正常对照组小鼠，模型组小鼠及给予 anti-TIM-1抗体处理组小鼠均出现毛发光泽度变差，且不同程度的活动减少，但实验过程中小鼠均未死亡。
　　2.四组小鼠肾组织病理损伤程度：HE染色切片光镜下可见 IgAN模型组肾小球系膜细胞有中至重度增生，肾间质出现纤维化样改变，炎性细胞广泛浸润，而IgAN+anti-TIM1组仅可见系膜轻度增生。小鼠Katafuchi评分为IgAN模型组（6.56±1.13）、IgAN+anti-TIM1组（3.22±0.97）显著高于正常对照组（1.33±0.50），且有统计学意义（P<0.01）；IgAN模型组 Katafuchi评分显著高于IgAN+anti-TIM1组，且有统计学意义（P<0.01）。肾组织IgA免疫荧光IgAN模型组在高倍镜下可见系膜区有+++～++++的颗粒状或团块状绿色荧光沉积，但是IgAN+anti-TIM1组仅有+~++的沉积。利用K-W H检验发现IgAN模型组、IgAN+anti-TIM1组免疫荧光分级高于正常对照组，且有统计学意义（P<0.01）；IgAN+anti-TIM1组免疫荧光分级低于IgAN模型组，且有统计学意义（P<0.01）。
　　3.免疫组织化学检测结果：IgAN模型组与IgAN+anti-TIM-1组中TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65在肾小球及肾小管的表达较正常对照组明显增多，且有统计学意义（P<0.01）；IgAN+anti-TIM-1组中TLR4、MyD88、TIM1、NF-κbp65的表达较IgAN模型组均明显下降，且差异有统计学意义（P<0.01)。
　　4. Western Blot检测结果：IgAN模型组和IgAN+anti-TIM-1组中TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65、IL-4、 IFN-γ的表达量都比正常对照组高，且差异有统计学意义（P<0.05）。在正常对照+anti-TIM-1组与正常对照组之间TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65、IL-4、 IFN-γ的蛋白表达量的差异无统计学意义（P>0.05）。IgAN+anti-TIM-1组中TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65、IL-4、IFN-γ的蛋白表达量低于IgAN模型组，且有统计学意义（P<0.05）。
　　5.实时荧光定量法检测结果：IgAN模型组和IgAN+anti-TIM-1组中TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65、IL-4mRNA表达水平均高于正常对照组，且有统计学意义（P<0.01）。在正常对照+anti-TIM-1组与正常对照组之间TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65、IL-4、IFN-γmRNA表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。IgAN+anti-TIM-1组中TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65、IL-4mRNA表达量低于IgAN模型组，且有统计学意义（P<0.01）。IgAN+anti-TIM-1组中IFN-γmRNA表达量低于IgAN模型组，但差异无统计学意义（P>0.05）。
　　6.相关性分析结果：IgAN组和IgAN+anti-TIM1组中TIM-1mRNA与IL-4、IFN-γ及IFN-γ/IL-4的相关性， TIM-1与IL-4、IFN-γ均为正相关，但没有统计学意义（P>0.05）；TIM-1与 IFN-γ/ IL-4呈负相关，相关性没有统计学意义（P>0.05）。IgAN组和IgAN+anti-TIM1组中TIM-1mRNA与肾脏病理Katafuchi评分及肾脏IgA免疫荧光分级的相关性分析，TIM-1与Katafuchi评分为正相关，相关性有统计学意义（P<0.05）；TIM-1与IgA免疫荧光分级呈正相关，并且相关性没有统计学意义（P>0.05）。
　　结论：
　　1.本研究成功构建IgA肾病小鼠模型。
　　2.在IgAN模型组肾脏组织中发现TIM-1表达上调，且与病理损伤程度呈正相关，但给予anti-TIM-1阻断TIM-1信号通路后，TIM-1表达下调，与病理损伤程度仍为正相关，提示在小鼠 IgAN中 TIM-1信号通路可能参疾病的发病及进展。
　　3. TIM-1与IL-4、IFN-γ的表达在 IgAN模型组肾组织中表达都上调，并且TIM-1与IL-4、IFN-γ均为正相关，与IFN-γ/ IL-4呈负相关，在模型组给与TIM-1抗体处理后，TIM-1与IL-4表达都下调，并且TIM-1与IL-4仍为正相关，与IFN-γ/ IL-4呈负相关，这提示在IgAN发病中Th2优势反应被TIM-1信号通路调控。
　　4. MyD88、TLR4、NF-κB的表达在 IgAN模型小鼠肾组织中的表达都升高，这提示在 IgA肾病的发病中 TLR4信号通路可能发挥作用。TLR4、MyD88、NF-κB在经过TIM1抗体处理后的IgAN组中表达都下降，这提示阻断TIM1信号通路可能通过下调TLR4等的表达来延缓IgA病情的发展。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第 2 章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 统计学处理

第3章 结果

3.1 四组小鼠一般情况比较

3.2 四组小鼠肾脏病理比较

3.3 IHC法检测小鼠肾脏TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65的表达

3.4 Western Blot检测小鼠肾脏TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65、IL-4、 IFN-γ的蛋白表达的变化

3.5 定量 RT-PCR 检测小鼠肾脏TIM1、TLR4、MyD88、NF-κbp65 、IL-4、IFN-γmRNA 水平的表达

3.6 TIM-1与IL-4、IFN-γ及肾脏病理损伤指标的相关性分析

第4章 讨论

4.1 IgAN小鼠模型的构建

4.2 IgAN中TIM1与Th1、Th2细胞的关系

4.3 IgAN中TIM1与TLR4、MyD88、NF-κB的关系

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

综述: TIM基因家族与Th细胞在疾病中作用的研究进展