不同提取方法下腰果蛋白功能性与结构的关系及其蛋白的纯化探索

摘要

腰果仁具有丰富的营养价值，是优质油脂和蛋白质来源之一，本文以腰果仁为原料，系统研究了不同提取方法下腰果仁中蛋白质功能性与结构的关系以及腰果蛋白组分的纯化和鉴定:后者主要包括（1）使用Osborne四步提取法粗分离提取腰果蛋白不同组分，并对其功能性与结构进行比较；（2）进一步使用凝胶色谱分离研究腰果清、球、谷蛋白的组成。试验结果表明：
　　1、采用碱提酸沉法和盐溶法提取腰果蛋白，得到腰果蛋白CNPI和CNSPI，纯度分别为80.7％和91.4%。通过对比两者功能性和结构等方面的变化，发现不同提取方法下的腰果蛋白在结构和功能特性上存在显著性的差异（p<0.05）。在中性环境下，碱提酸沉法得到的腰果蛋白（CNPI）具有更好溶解性、起泡性、起泡稳定性及较高的表面疏水性。而盐溶法提取的腰果蛋白（CNSPI）则具有更高的蛋白纯度、乳化性（30.14 m2/g）及乳化稳定性(138.58 min)。SDS-PAGE和氨基酸分析发现不同提取方法下的腰果蛋白在亚基组成和氨基酸组成上存在很大的相似性，富含谷氨酸和天冬氨酸，且腰果蛋白主要是由一条53 kDa的亚基组成，而它是由21 kDa和32 kDa的两条多肽链通过二硫键键合而成。在微观形貌上，碱提酸沉法得到的腰果蛋白呈现表面光滑的大片状结构，而盐溶法的微观形貌呈现不规则形状，有较小的球状颗粒。此外，碱提酸沉法得到的腰果蛋白相比盐溶法含有较少的α-螺旋和不规则卷曲。由此表明碱提酸沉法较盐溶法提取会造成腰果蛋白结构上更大程度的变性，从而造成其功能性质的差异。
　　2、采用Osborne四步提取法粗纯化得到腰果蛋白四组分，分别为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，纯度分别为83.60%、95.51%、20.52%、81.30%。蛋白含量从大到小依次是球蛋白>清蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。清、球、谷蛋白的溶解度随pH的增加而不断增加。在中性环境下，清蛋白和球蛋白几乎全部溶解，谷蛋白溶解度也达到79.88%，三者在溶解度上远高于市售大豆分离蛋白。谷蛋白在持水性、持油性、起泡性及起泡稳定性上性能最佳，同时谷蛋白的表面疏水值也是最高的，这说明谷蛋白是一种典型的两亲性蛋白。而清蛋白在乳化性能上最好，高于球蛋白和谷蛋白，且三者皆优于大豆分离蛋白。腰果蛋白各组分氨基酸比例好，缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸含量能满足FAO/WHO/UNO推荐儿童标准，谷蛋白中的苏氨酸、亮氨酸含量接近儿童推荐标准。SDS-PAGE分析表明，腰果清蛋白、球蛋白在多肽链组成上存在相似性，但与谷蛋白有着明显的差异：腰果清蛋白和球蛋白主要是由一条21、32 kDa的多肽链通过链间二硫键键合成的53 kDa的亚基组成；谷蛋白分子量则较大；醇溶蛋白主要是由分子量为17、9 kDa的两条多肽链组成。腰果蛋白二级结构主要为β-折叠构象。清蛋白、球蛋白在微观形貌上相似，与谷蛋白的大片状结构相比，呈现许多球状且夹杂着其他不规则结构。由此表明腰果各组分蛋白质在组成、分子量和蛋白质构象上存在的明显差异与其功能特性变化存在一定的关系。
　　3、采用凝胶色谱对腰果清蛋白、球蛋白、谷蛋白三组分进行进一步分离，发现清蛋白主要有3种组分，分子量分别在>669 kDa，13.7-29 kDa，6.5 kDa范围内；球蛋白主要含有4种组分，分子量分别在>669 kDa，253-440 kDa，13.7-29 kDa，6.5 kDa范围内；谷蛋白则组分较为单一，只出现一条明显的峰且分子量较大。通过比较不同洗脱流速和洗脱液发现选用pH7.0，0.01 M PBS(含0.15 M NaCl)洗脱液在0.2 mL/min的流速下蛋白洗脱效果最好。

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第1章 绪论

1.1 引言

1.2 油料植物蛋白的提取、功能及结构性质

1.3 蛋白质的分离纯化

1.4 腰果蛋白的研究现状

1.5 本课题的研究意义、研究内容和创新点

第2章 不同提取方法对腰果蛋白功能性及结构的影响

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 腰果蛋白分步分离、功能性及结构表征的研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 腰果分离蛋白色谱纯化初探

4.1 引言

4.2 材料与设备

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

第5章 结果与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果