基于HCR及生物素-链霉亲和素信号放大系统检测大肠杆菌O157:H7的研究

摘要

大肠杆菌O157:H7是大肠杆菌中的一种具有高致病性的食源性致病血清型，有报道称低于10个菌就能够致病，如何快速灵敏地检测大肠杆菌O157:H7引起了广泛关注。因此，本文分别建立了传统ELISA方法、基于生物素–链霉亲和素信号放大的ELISA方法、集成杂交链式反应和生物素–链霉亲和素信号放大的ELISA方法，旨在找到一种准确快速的ELISA方法高灵敏检测大肠杆菌O157:H7。
　　本文首先采用传统的双抗夹心ELISA方法检测大肠杆菌O157:H7。通过优化抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的浓度，传统的ELISA方法在培养基和牛奶样品当中的灵敏度分别为4.88×104 CFU/mL和5.08×104 CFU/mL，变异系数分别为1.31％–6.87%和1.52%–7.81%。
　　采用生物素–链霉亲和素信号放大ELISA方法检测大肠杆菌O157:H7，通过优化生物素化抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体浓度，在培养基和牛奶样品中灵敏度分别为2×104 CFU/mL和3.23×104 CFU/mL，变异系数分别为1.12%–8.63%和1.25%–9.61%。两种传统ELISA方法特异性良好，变异系数低，稳定性好，均能实现对牛奶样品的加标检测，但两种方法的灵敏度都较低。
　　本文最后构建了基于HCR及生物素–链霉亲和素信号放大系统的双抗夹心ELISA方法，实现了对大肠杆菌O157:H7的快速灵敏检测。将大肠杆菌O157:H7的多抗包被在酶标板之后，加入标记了大肠杆菌O157:H7单抗和DNA1引发序列的胶体金复合物。当存在目标菌株时，将会形成多抗–目标菌–单抗–胶体金–DNA1复合物。复合物与加入的生物素化H1和生物素化H2发生杂交链式反应，形成一个带缺口的包含大量生物素的双链结构DNA，生物素将与链霉亲和素化的酶发生酶催化底物显色反应。通过优化胶体金探针单抗、多抗、生物素化H1及H2加入浓度，DNA1标记量，封闭剂的选择，HCR反应时间，酶反应动力学时间及温度，得到的最优条件为：单抗标记量150μg/mL；多抗包被浓度10μg/mL；生物素化H1及H2加入浓度0.25 nmol/mL；DNA1标记量400μL（1 nmol/mL）；封闭剂选择为3% BSA；HCR反应时间为75min；酶反应动力学时间和温度分别为10 min和37℃。在最优条件下，大肠杆菌O157:H7的检测线性范围为5×102–1×107 CFU/mL，在培养基和牛奶样品中灵敏度分别为1.08×102 CFU/mL和2.60×102 CFU/mL。特异性实验表明该方法特异性良好，并且在培养基和牛奶样品当中的变异系数分别为0.99%–5.88%和0.76%–5.38%。
　　本文建立的基于HCR及生物素–链霉亲和素信号放大ELISA方法与传统双抗夹心ELISA和生物素–链霉亲和素信号放大ELISA相比，灵敏度分别提高了451倍和185倍。综上所述，本文所建立的新型ELISA方法特异性强，灵敏度高，稳定性好，可以实现对大肠杆菌O157:H7的快速灵敏检测。

目录

声明

缩略语表

第一章 前言

1.1 研究背景及意义

1.2 大肠杆菌O157:H7检测方法研究进展

1.3 核酸探针信号放大检测方法

1.4 生物素–链霉亲和素生物反应体系

1.5 本文的研究内容和意义

第二章 传统的双抗夹心ELISA

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 小结

第三章 基于生物素–链霉亲和素信号放大的ELISA

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 小结

第四章 基于HCR及生物素–链霉亲和素信号放大系统ELISA

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录1 主要实验菌株

附录2 主要实验试剂

附录3 主要实验仪器设备

个人介绍

攻读学位期间的研究成果