基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb2+荧光传感方法

摘要

本发明属于食品安全、环境监测技术领域，尤其是基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb2+荧光传感方法，组装DNA四面体三维纳米结构，在四个顶点连接发卡DNA，发卡上标记可发生FRET(荧光共振能量转移)效应的荧光基团。该基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的荧光传感方法，通过设置组装三维DNA纳米结构，借助刚性纳米结构的高稳定性，DNA四面体中多维分离的四个顶点使得HCR可以朝不同的方向进行，这增加了碰撞概率，构建的传感体系高效灵敏稳定。

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全、环境监测技术领域，尤其涉及一种基于 DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

背景技术

随着工农业生产的迅速发展，环境保护、食品安全已成为制约世界尤其是我国可持续发展的重大问题。作为主要污染源之一的重金属污染也引起了社会的广泛关注。而Pb

而当前最可靠、最有效的分析方法还是常规的实验室检测方法：如电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)、原子吸收光谱法(AAS)、原子发射光谱法(AES)等，虽然都可以实现高灵敏、高选择性的检测，但以上方法多依赖于精细昂贵的大型仪器，需要复杂的样品前处理过程和专业的技术人员操作，只能在实验室条件下进行，未能满足便携式检测的要求，很难应用于现场原位实时检测当中。而当前存在的环境污染、食品安全问题具有很强的突发性、时效性、频繁性，因此对检测技术提出了更高的要求。为了能够及时准确的做出应对方案，将污染和伤害降到最低，人们迫切需要一种便捷、实时、灵敏、现场的分析手段。正是由于意识到了这一点，人们有关重金属检测的研究不再局限于实验室，而是逐渐向着原位现场的方向发展，使技术逐渐向着简单化、便携化、经济化的方向发展，使设备逐渐小型化、便携化、集成化方向发展，而这一转变已经成为一个新的研究热点。

近来新兴发展的生物传感器用于重金属离子检测的技术不仅样品处理过程简单，无需昂贵仪器，且具有简单、高效、灵敏的特点，为实现重金属离子的现场在线检测提供了极大的可行性。DNA传感器是生物传感器的一种，其用于重金属离子检测技术的兴起源于功能核酸的发现，功能核酸是指功能超越了传统意义上遗传作用的核酸分子，包括核酸适体，脱氧核酶和分子信标等。而金属离子类功能核酸是指在特定离子存在下，可以显示特殊功能的核酸分子。功能核酸具有易于设计修饰、稳定性好、环境友好以及对目标分子高度识别的特异性等一系列优点，上述特点为其用于生物传感器的设计提供了多种便利条件，也是近几年来有关功能核酸类传感器的研究获得迅猛发展的一个重要原因。人们在这方面开展了大量的研究工作，并与多种信号输出方式相结合，例如荧光、比色法、电化学和磁共振等，设计了一系列高灵敏度、高特异性的金属离子传感器，实现了多种重金属离子的检测。

但就目前的基于功能核酸的金属离子传感器而言，绝大多数仍处于实验室阶段。若要实现环境、食品等体系中重金属离子的现场及在线检测，仍然有许多问题亟待解决，其中比较突出的两个问题为：传感器的响应速度和检测灵敏度都有待进一步提高。为了进一步提高传感器的响应速度和检测灵敏度，我们将基于Watson-Crick碱基互补配对原则以及核酸可控自组装原理，创建三维DNA纳米结构介导的非酶促恒温核酸扩增机制，基于核酸扩增信号放大技术以及空间约束效应和有效碰撞理论，构建高效灵敏稳定的传感体系，并进一步应用于水体、食品等样品中Pb

发明内容

基于现有的技术问题，本发明提出了一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

本发明提出的一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的 Pb

步骤二、通过Pb

步骤三、基于FRET荧光信号对Pb

优选地，所述四面体DNA纳米结构由四条寡核苷酸链组成，发卡结构有HA8和HB8两种，Pb

优选地，所述发卡结构HA8标记荧光基团cy3，HB8标记荧光基团cy5，GR5序列包括酶链(GR5)和底物链(S

优选地，所述四面体DNA纳米结构在缓冲液Tris-HCl和MgCl

优选地，所述Pb

优选地，所述基于DNA四面体三维纳米结构介导的HCR信号放大技术的Pb

优选地，方法主要分为纳米结构的自组装以及Pb

本发明中的有益效果为：

1、通过设置组装三维DNA纳米结构，借助刚性纳米结构的高稳定性，DNA四面体中多维分离的四个顶点使得HCR可以朝不同的方向进行，这增加了碰撞概率，构建的传感体系高效灵敏稳定。

2、通过设置在传感器引入非酶促核酸扩增技术，可以在定量目标物存在下引发核酸扩增反应,富集大量的信号输出单元，放大检测信号，提高检测的灵敏度，其温和的反应条件使之能够在恒温甚至室温下进行，更适用于现场在线分析检测。

3、通过设置利用三维纳米结构加速的HCR，所提出的传感平台对Pb

附图说明

图1为本发明提出的一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

图2为本发明提出的一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

图3为本发明提出的一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

图4为本发明提出的一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

图5为本发明提出的一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

图6为本发明提出的一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

图7为本发明提出的一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1-7，一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的 Pb

进一步地，步骤二、通过Pb

进一步地，步骤三、基于FRET荧光信号对不同Pb

四面体DNA纳米结构由四条寡核苷酸链组成，发卡结构有HA8和 HB8两种，Pb

通过设置组装三维DNA纳米结构，借助刚性纳米结构的高稳定性，DNA四面体中多维分离的四个顶点使得HCR可以朝不同的方向进行，这增加了碰撞概率，构建的传感体系高效灵敏稳定；

通过设置在传感器引入非酶促核酸扩增技术，可以在定量目标物存在下引发核酸扩增反应,富集大量的信号输出单元，放大检测信号，提高检测的灵敏度，其温和的反应条件使之能够在恒温甚至室温下进行，更适用于现场在线分析检测；

通过设置利用三维纳米结构加速的HCR，所提出的传感平台对 Pb

实施例一

一种基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb

(1)将4种摩尔浓度相同的低聚核苷酸(a*、b*、c*和d*)在含有 10mM MgCl

(2)发卡DNA的制备:分别将HA8cy3或HB8cy5加入缓冲液(20mM Tris-HCl,10mMMgCl

(3)TDN组装发卡的制备:将TDN和发卡DNA(HA8cy3-hairpin 或HB8cy5-hairpin)按1:4的浓度在含有10mM MgCl

(4)25℃孵育30min，形成TDNHA8cy3和TDNHB8cy5。

将制备好的TDN

(5)首先将50nM的GR5和50nM的S

二、传感体系应用于样品检测前的处理过程：

从小清河(天津南开区)收集河水，然后通过0.45μm膜进行过滤，以除去较大的不溶性颗粒和藻类。用研磨机分别粉碎0.5g谷物， 5g蔬菜，并混入10mL HNO

本发明灵敏度高，反应时间短，提供了一种可适用于离子浓度低的环境水体检测以及谷物蔬菜水果等食品中Pb

三、下面结合附图详细说明本发明制备的传感体系的结构和性能

(1)电泳分析

首先，通过2％琼脂糖凝胶电泳(100V，30分钟)分离反应溶液。凝胶预先用GelGreen染色，并用成像系统可视化。如图1所示，通过连续添加寡核苷酸链与发卡(1—5：a*，b*，c*，d*和HA8cy3)，亮带位置连续增加，电泳迁移率连续降低，这表明四面体结构和TDNHA8结构成功组装。

(2)原子力显微镜分析

本发明用原子力显微镜(AFM)观察反应溶液的结构，在不存在目标Pb

(3)粒径检测分析

当HCR反应中没有Pb

(4)传感体系的灵敏度

为了考察该方法对Pb

(5)传感体系的特异性

为了证明这种方法检测Pb

所有DNA和RNA寡核苷酸均购自Sangon Biotech Co.Ltd.(中国上海)，并通过高效液相色谱法纯化。三(羟甲基)氨基甲烷(Tris) 获自Sigma-Aldrich。本发明中使用的MgCl

所有的荧光测量均在Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪(日本 Shimadzu Ltd.)上进行，使用540nm作为激发波长，并且波长范围为550-800nm。在XP循环仪(杭州博瑞科技有限公司，中国杭州) 上进行孵育或退火。在Shimadzu UV-2450光谱仪(Shimadzu Ltd.，Japan)上进行UV光谱测量。在Agilent Technologies 5500(美国) 上进行了AFM测试，以观察样品的形态。在Malvern Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，Ltd.，Worcestershire，UK)上进行了动态光散射(DLS)实验。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。