p85与S-2结合调控ERK/MAPK通路的活化

摘要

Spred(Sprout-related Ena/vasodilator stimulated phosphoprote in homology-1(EVH-1)domain)蛋白家族与Sprouty相关，包括3个主要结构域:N端结构域（EVH-1区），中央c-kit结合区（KBD区）和C端的半胱氨酸富含区（SPR区）。EVH1区是特异结合富含脯氨酸的序列，将蛋白锚定到特定位点行使功能，例如:骨架重构;肌动蛋白调节;突触转导;增殖和分化等。KBD区是包含一段致癌受体酪氨酸激酶c-kit的结合序列，对生长因子(EGF、EPO)介导的ERK/MAPK的活性有抑制作用，但非必需。SPR区是非常保守的富含半胱氨酸sprouty相关序列，负向调节生长因子介导的Erk的活性。同时Spred对多种生长因子诱导的Ras-ERK途径有抑制作用。Spred蛋白家族负向调节Ras/ERK通路并影响细胞增殖和细胞分化，SPR区在该过程中起重要作用，然而其作用机制尚未阐明。本研究发现，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的p85亚基与Spred-2蛋白的SPR区相结合。此外，SPR区的第303位、343位、353位酪氨酸共同突变不仅能够剥夺表皮生长因子介导的Spred-2蛋白与p85亚基的结合，还会减弱Spred-2蛋白对Ras/ERK活化作用的抑制。因此与野生型相比，Spred-2蛋白突变体导致Hela细胞增殖加快、PC12细胞分化加强。进一步的研究表明，p85亚基与Spred-2蛋白的结合能够增强Ras蛋白与Spred-2蛋白结合，同时还能降低Spred-2蛋白本身的泛素化，从而进一步加强Spred-2蛋白的抑制作用，影响Ras/ERK活化。取得的研究结果如下:
　　 1、293T细胞经脂质体转染pRK5-Myc-Spred-2质粒及其各段缺失体，经饥饿、刺激等处理后通过免疫共沉淀实验和Westernblot检测发现p85亚基与Spred-2蛋白结合并且依赖于Spred-2蛋白的SPR区和p85亚基的SH2区。
　　 2、采用分子亚隆克技术及PCR法定点诱变分别构建了Spred-2蛋白SPR区第303位、343位、353位酪氨酸的单突变体，343位、353位酪氨酸的双突变体以及同时突变三个位点的三突变体，进行免疫共沉淀实验和Westernblot检测到SPR区的第303位、343位、353位酪氨酸共同突变不仅能够剥夺表皮生长因子介导的Spred-2蛋白与p85亚基的结合，还会减弱Spred-2蛋白对Ras/ERK活化的抑制。
　　 3、将空载体、p85亚基及其缺失体分别与Spred-2蛋白和Ras蛋白共转染，发现p85亚基与Spred-2蛋白的结合能够增强Ras蛋白与Spred-2蛋白相互作用，同时还能降低Spred-2蛋白本身的泛素化，从而进一步加强Spred-2蛋白的抑制作用。
　　 4、通过构建空载体、Spred-2蛋白及其突变体、缺失体的重组腺病毒分别感染Hela和PC12细胞、采用台盼蓝计数法和神经突触伸长分析发现与野生型相比，Spred-2蛋白p85亚基结合位点的突变体导致Hela细胞增殖加快、PC12细胞分化加强。
　　 综上所述，本研究发现经EGF刺激后，p85亚基被招募至Spred-2蛋白，且Spred-2蛋白的Tyr303、343及353位点对于EGF诱导的p85亚基与Spred-2蛋白的结合及Spred-2蛋白对Erk1/2活化的抑制均是必需的。p85亚基与Spred-2蛋白能够增强Ras蛋白与Spred-2蛋白结合，同时还能降低Spred-2蛋白本身的泛素化，从而进一步加强Spred-2蛋白的抑制作用，这是有关Spred-2蛋白与p85亚基相互作用参与调节EGF介导的Erk1/2活化的首次研究。

目录

符号说明

第一章 Spred蛋白家族研究进展

1．Spred蛋白家族各区域及功能

1．1 EVH1区域

1．2 KBD区域

1．3 SPR区域

2．Spred蛋白家族的表达模式及细胞定位

2．1 Spred蛋白家族的表达模式

2．2 Spred蛋白家族的细胞定位

3．Spred蛋白家族的结合蛋白

4．Spred蛋白家族对信号通路的影响及生物学功能

4．1 Spred蛋白家族的调节功能

4．2 Spred蛋白家族对Ras/MAP激酶的抑制功能

5．P13K及p85简介

参考文献：

第二章 p85与Spred-2结合调控ERK/MAPK通路的活化

前言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 P13K的调节亚基p85与Spred2蛋白的结合

2．2 Spred2蛋白SPR区第303、343、353位氨基酸对p85与Spred2的结合及Spred2蛋白对Ras/ERK活化的抑制作用是必需的

2．3 p85与Spred2结合后通过增强Ras与Spred2的结合和降低Spred2泛素化来增强Spred2的抑制作用

2．4 Spred2蛋白关于p85结合位点的突变体促进了细胞增殖及PC12细胞分化

3 讨论

参考文献

致谢

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