CCD-RSM对增加骨密度保健功能食品的研究及配方设计

摘要

本课题主要研究生物碳酸钙(Biological Calcium Carbonate)、胶原蛋白(Collagen)、硫酸软骨素(CS)、氨基葡萄糖(GS)四种主要功能成分复合协同增加骨密度的作用。细胞模型选取的是MC3T3-E1前体成骨细胞，通过采用星点设计(CCD)-效应面优化法(RSM)进行四因素五水平的CCD，通过采用Design Expert8.0.6实验设计软件来优化得到最优的实验方案，开展四种主要功能成分的复合协同增加骨密度的作用的研究，并通过采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测以及矿化结节检测，最终得到这四种主要功能成分的最优配方，尤其探讨了四种主要功能成分的最佳组合配方，为提高成分组合的科学性和临床性，增加骨密度的功能食品提供了科学方法以及实验依据。
　　在筛选出四种主要功能成分的最优配方的基础上，继续采用CCD-RSM，分别选择麦芽糊精(Maltodextrin)、木糖醇(Xylitol)、L-苹果酸(L-malic acid)的添加量为影响钙胶原蛋白增加骨密度咀嚼片综合感官评分的考察因素，进行三因素五水平的CCD，通过采用Design Expert8.0.6实验设计软件以及方差分析对实验数据结果进行分析，即对钙胶原蛋白咀嚼片的综合感官品质的影响的主次因素为:麦芽糊精＞L-苹果酸＞木糖醇，并且三个考察因素之间存在极明显的交互作用。因此，最终确定了钙胶原蛋白咀嚼片的最优配方。
　　本论文主要结果如下:
　　1、采用（3-4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐法(3-4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)，即MTT法来计算细胞的存活率，分析计算MC3T3-E1前体成骨细胞的增殖率。
　　2、采用Design Expert8.0.6实验设计软件，处理实验结果建立多元二次回归数学模型预测。根据建立的多元二次拟合方程绘制出考察因素对效应指标影响的趋势的二维等高线图和三维效应图，根据绘制的二维等高线图和三维效应图选择最佳的组合比例，并进行验证实验。根据各组实验数据对各项指标进行偏差值的计算，来证明建立的多元二次回归数学模型对实验结果预测准确度的大小。
　　3、实验预测值为（62.75％±0.08），实验测得值是（65.69％±0.05）四者协同对MC3T3-E1前体成骨细胞的增殖作用，通过CCD的31组实验得到的最大增值率为65.69％，而市售某胶原软骨素钙片增加骨密度的增值率为60.74％，通过得出的实验数据可知市售某胶原软骨素钙片中主要成分的作用不如生物碳酸钙、胶原蛋白、CS、GS四者协同增加骨密度的作用显著。其中31组实验中的前4组为较优配方用于第三章节的验证实验的实验分组。
　　4、通过改良的Gomori氏钙钴法检测碱性磷酸酶活性来确定成骨细胞(OB)的分化程度以及功能状态。
　　5、通过采用茜素红染色法检测矿化结节来筛选出该实验的最佳配方。
　　6、通过4和5的实验研究，在4组较优方案中最终确定第1组方案为最佳配方，第1组中四种主要功能成分的剂量为增加骨密度功能食品的最佳配方比例。
　　7、根据得到的增加骨密度保健功能食品配方的最佳配方，验证多元二项式拟合方程的有效性，通过重复验证实验，感官评分的实测值为8.79，多元二项式拟合方程的预测值为8.73，二者相差0.06比较接近，表明该模型是科学合理有效的，该方程能够较好地预测并筛选出理论综合的感官评分，具有现实指导意义，可用于钙胶原蛋白咀嚼片的研发。
　　8、综合考虑效应面能够指出考察因素各自最优区域为:麦芽糊精的添加量为10％、木糖醇的添加量为3.1％、L-苹果酸的添加量为0.15％。
　　9、探讨CCD-RSM在保健食品中多因素、多水平的实验中的应用。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 选题依据

2 增加骨密度功能食品配方的研究现状

2．1 生物碳酸钙的研究现状

2．2 胶原蛋白的研究现状

2．3 CS与GS的研究现状

2．4 OB的研究现状

3 CCD-RSM

3．1 CCD-RSM的基本观点及概念

3．2 CCD-RSM的基本原理

3．3 效应面的设计

3．4 多元线性或非线性拟合

3．5 模型优化与预测

3．6 CCD-RSM与均匀设计以及正交设计优化法的优缺点比较

第二章 CCD-RSM对增加骨密度功能食品配方的作用研究

1 引言

2 实验材料、仪器和试剂

2．1 实验材料

2．2 实验所用细胞株

2．3 实验仪器与设备

2．4 实验试剂

3 实验设计

4 实验方法

4．1 细胞培养

4．2 MC3T3-E1 前体成骨细胞鉴定

5 实验结果

5．1 MC3T3-E1 前体成骨细胞的形态变化

5．2 MC3T3-E1 前体成骨细胞生长曲线

5．3 实验结果的数学模型的拟合

5．4 实验结果的AVOVA分析

5．5 效应面分析与预测

5．6 效应面最优方案

6 讨论

7 小结

第三章 增加骨密度功能验证实验

1 引言

2 实验材料、仪器和试剂

2．1 实验材料

2．2 实验所用细胞株

2．3 实验仪器和设备

2．4 实验试剂

3 实验方法

3．1 实验分组

3．2 细胞的复苏与传代

3．3 ALP活性

3．4 矿化结节

4 实验结果

4．1 ALP活性检测

4．2 矿化结节

5 讨论

6 小结

第四章 增加骨密度功能食品的研制

1 引言

2 实验材料、仪器和试剂

2．1 实验材料

2．2 实验仪器和设备

2．3 实验试剂

3 实验设计

3．1 感官评价

3．2 CCD-RSM

4 实验方法

4．1 实验工艺流程

4．2 配料的选择

4．3 预测

4．4 验证

5 结果与分析

5．1 单因素试验

5．2 实验结果的数学模型的拟合

5．3 实验结果的AVOVA分析

5．4 效应面分析与预测

5．5 效应面最优方案

6 讨论

7 小结

全文总结

参考文献

致谢

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