哺乳期安赛蜜暴露影响成年小鼠甜味偏好机制初步研究

摘要

甜味偏好具有可塑性，发育早期的味觉经历可改变后期的甜味偏好。而该可塑性的形成机制目前尚不清楚。本课题在建立甜味偏好可塑性动物模型的基础上，对甜味偏好可塑性的外周味觉分子机制进行了深入研究。我们以ICR小鼠作为实验对象，在哺乳期（P4-P21）给予母鼠不同浓度的安赛蜜（acesulfame-K，AK）饮水暴露，其子代小鼠通过母乳接受AK暴露。随后，对成年子代小鼠进行双瓶喜好（Two-bottle-preference，TBP）测试，观察其对不同甜味剂的偏好阈值和偏好率变化，寻求合适的AK暴露剂量，建立一个稳定的甜味偏好可塑性动物模型。在此基础上，采用qRT-PCR、Western blot、免疫组化和ELISA等实验方法检测小鼠在暴露刚结束时（P21）及TBP实验即将开始前（P49），其外周味觉系统舌面菌状味蕾和软腭味蕾形态变化和味细胞内甜味信号传导相关分子的变化，探讨小鼠甜味偏好可塑性变化的细胞和分子生物学机制。
　　母鼠哺乳期接受不同浓度AK暴露，对其成年子代小鼠进行TBP测试发现：生后早期0.15mM、1.5mM暴露17天（P4-P21）和5mM暴露10天（P4-P14）对成年子代小鼠AK偏好无影响。而5mM、12.5mM、25mM和50mM暴露17天（P4-P21）均不同程度提高了成年小鼠AK偏好阈值，降低AK糖偏好率：对照组小鼠偏好阈值为0.13mM，而5mM和12.5mM暴露组偏好阈值升高至0.42mM,25mM和50mM暴露组偏好阈值为1.33mM；与对照组相比，暴露组小鼠成年时对偏好阈值附近浓度的AK糖偏好率降低，分别为：5mM AK暴露显著降低小鼠对0.42mM AK偏好率；12.5mM、25mM、50mM暴露组偏好率显著降低的浓度分别为1.33mM和13.28mM、0.42mM和1.33mM、0.13mM和0.42mM。对小鼠的体重监测（P4-P49）发现：25mM和50mM AK暴露显著降低了小鼠在成年时的体重，可能影响小鼠的生理健康；而5mM和12.5mM AK暴露对小鼠体重无影响。所以我们选择以5mM和12.5mM暴露17天（P4-P21）的方式来构建动物模型。我们还发现，早期AK暴露组小鼠对其他甜味剂（蔗糖和糖精）的偏好阈值也提高，偏好率发生变化：5mM AK暴露组小鼠对蔗糖偏好阈值由对照组的12mM升高至38mM；对糖精的偏好阈值由0.13mM升高至0.43mM。同时5mM AK暴露降低了小鼠对1400mM蔗糖的偏好率，提高了小鼠对430mM糖精的厌恶程度。由此可见，哺乳期AK暴露改变了小鼠成年时期的甜味偏好阈值和偏好率。
　　对外周味觉系统舌面和软腭味蕾研究显示，与对照组相比，AK暴露组小鼠的舌或软腭组织中，trpm5以及其它甜味转导相关的重要分子（包括t1r2、t1r3、Gα-gust、cb1和ob-rb）的mRNA在P21或P49时，均没有显著改变。免疫印迹实验和形态学研究结果发现：5mM AK暴露刚结束时（P21），小鼠舌面和软腭中甜味受体T1R2和T1R3、Gα-gustducin和TRPM5的蛋白表达，与对照组相比没有显著改变。而调控甜味信号的激素分子受体发生变化：舌面味蕾中甜味正调控分子CB1受体表达增加了1.3倍，而软腭上甜味负调控分子leptin受体Ob-Rb表达降低了约30%。在小鼠成年时（P49），暴露组小鼠舌面上甜味受体T1R2表达升高约90%，单个味蕾中Gα-gustducin阳性味细胞数目增加约25%；而软腭上Gα-gustducin表达降低了约80%，Ob-Rb蛋白水平升高了1.7倍。同时软腭味蕾最大横截面积减小约20%，舌面味乳头数目和味蕾形态无显著改变。
　　此外，对早期AK暴露小鼠在青少年和老年时期的甜味偏好研究发现：哺乳期AK暴露，降低子代小鼠在青少年期的蔗糖偏好阈值和偏好率；提高小鼠老年期的AK偏好阈值。同时哺乳期AK暴露可能抑制小鼠衰老过程中偏好率下降的趋势。
　　综上，哺乳期AK糖暴露提高成年小鼠甜味偏好阈值，偏好率也发生一定改变。同时，小鼠外周味觉系统中发生可塑性变化，舌面和软腭味蕾中甜味信号转导分子和调控甜味信号激素分子受体的蛋白表达发生改变，这些变化可能是甜味偏好发生可塑性变化的外周机制。此外，早期的甜味剂经历对青年时期和老年时期甜味偏好具有不同程度的影响。

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综述

第一章 哺乳期安赛蜜暴露改变小鼠成年甜味偏好模型的建立

1. 引言

2. 实验材料

3. 实验设计及方法

4. 实验结果

5．讨论

第二章 哺乳期安赛蜜暴露改变小鼠成年时期甜味偏好的外周机制探讨

1. 引言

2. 实验材料

3．实验设计与方法

4. 实验结果

第三章 哺乳期安赛蜜暴露对小鼠青少年和老年时期甜味偏好影响

1. 引言

2. 实验材料

2. 实验设计和方法

4. 实验结果

5. 讨论

本文结论

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文

致谢