MiR-34a通过Wnt/β-catenin信号通路影响神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡

摘要

目的:
　　应用文献检索和生物信息库预测,寻找miR-34a参与调控Wnt/β-catenin信号通路的线索。通过分子生物学技术在神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)中过表达miR-34a,而后检测Wnt/β-catenin信号通路活性的变化,以及肿瘤细胞增殖和凋亡的情况。为阐明miR-34a和Wnt/β-catenin信号通路在神经母细胞瘤发病机制中的作用提供依据,也为进一步研究神经母细胞瘤发生的分子机制和基因治疗方法提供新的思路和实验依据。
　　方法:
　　1、检索相关文献资料并应用生物信息学方法——靶基因预测软件(PicTar、Target Scan、microRNA.org、RNA22)预测并分析可能调控Wnt/β-catenin信号通路的microRNA,同时预测miR-34a潜在的靶基因。
　　2、构建miR-34a的模拟物并将其转入SK-N-SH细胞中,再以半定量反转录PCR(RT-PCR)、荧光定量PCR(Real-time PCR)检测miR-34a在细胞中的表达情况。
　　3、在SK-N-SH细胞中过表达miR-34a后,虫荧光素报告实验分析Wnt1和catenin-δ-1的mRNA转录活性,以及β-catenin/TCF的转录活性;蛋白免疫印记法(Western-blot)检测Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白(Wnt1、β-catenin、Cyclin D)的表达水平;免疫共聚焦显微镜观察β-catenin核转位情况。
　　4、在SK-N-SH细胞中过表达miR-34a后,采用MTT法检测肿瘤细胞增殖情况,并运用流式细胞分析细胞凋亡情况。
　　结果:
　　1、经过文献查阅以及PicTar、Target Scan、microRNA.org、RNA22四种软件共同预测,miR-34a可能参与调控Wnt/β-catenin信号通路,catenin-δ-1为miR-34a潜在靶基因。
　　2、RT-PCR及Real-time PCR证实构建的miR-34a模拟物能使miR-34a在SK-N-SH细胞中过表达。
　　3、在SK-N-SH细胞中过表达miR-34a后Wnt1和catenin-δ-1的mRNA转录活性,以及β-catenin/TCF的转录活性均受到抑制;Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白(Wnt1、β-catenin、Cyclin D)的表达水平下降;同时,β-catenin的核转位也受阻。
　　4、在SK-N-SH细胞中过表达miR-34a后,肿瘤细胞增殖水平下降,细胞凋亡增多。以对照组SK-N-SH细胞为参照,实验组细胞在第24h、48h和72h的细胞生长抑制率分别为40.8％、20.9%和18.2%;实验组细胞在第24h、48h和72h的细胞凋亡率分别为对照组的2.09、2.25和1.77倍。
　　结论:
　　在神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)中过表达miR-34a,miR-34a可以通过Wnt/β-catenin信号通路的经典途径,抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。

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引言

材料和方法

1. 材料

2. 方法

结果

1. 筛选调控Wnt/β-catenin的microRNA

2. miR-34a在SK-N-SH细胞中过表达

3. miR-34a在SK-N-SH细胞中与靶基因Wnt1和catenin-δ-1的3' UTR结合情况

4. miR-34a在SK-N-SH细胞中过表达后中对Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白（Wnt1、β-catenin、CyclinD ）表达的影响

5. miR-34a在SK-N-SH细胞中过表达后对TCF转录活性以及β-catenin向细胞核内的转位的影响

6. miR-34a在SK-N-SH细胞中过表达后对细胞增殖的影响

7. miR-34a在SK-N-SH细胞中过表达后对细胞凋亡的影响

8. miR-34a在SK-N-SH细胞中通过Wnt/β-catenin信号通路抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的机制模式图（图8）。

讨论

1. Wnt/β-catenin信号通路与神经母细胞瘤

2. 调控Wnt1的microRNA的预测和验证

3. miR-34a靶基因的预测和验证

4. miR-34a与神经母细胞瘤

5. miR-34a、Wntl1、catenin-δ-1与神经母细胞瘤

结论

综述

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文

攻读学位期间承担的科研项目

致谢