Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用

摘要

本发明属于分子遗传生物学领域，公开了Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用。其中，所述的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂优选β-catenin的siRNA。本发明针对β-catenin基因设计化学合成β-catenin-siRNA，通过脂质体转染颗粒细胞以敲减猪卵巢颗粒细胞内的β-catenin基因。结果显示，当β-catenin表达被抑制后，与空白组相比，实验组凋亡细胞数明显增加由8.80％上升到15.85％，差异显著，说明β-catenin-siRNA能够促进颗粒细胞的凋亡。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传生物学领域，涉及Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞 凋亡的药物中的应用。

背景技术

β-连环蛋白(β-catenin)作为Wnt信号通路中的核心转录因子，在卵巢发育过程中发 挥着重要作用，其表达缺失或者突变都会引起Wnt/β-catenin信号转导紊乱，从而对机体组 织或细胞产生重要影响。敲除Wnt4可导致小鼠在出生前部分的性反转以及卵母细胞的衰竭， 在敲除β-catenin的小鼠颗粒细胞中形成内含紊乱和多形性粒层细胞的卵泡样结构，可导致 颗粒细胞癌的发生。以上这些发现说明Wnt/β-catenin对颗粒细胞的增殖、分化以及存活有 深刻的影响，进而对卵巢正常功能的维持有着重要的作用。然而，这一结论还需要更多的实验 支持。

目前，本领域对于在体外实验中，β-catenin是促进细胞凋亡还是抗凋亡还存在着争议。 但过表达β-catenin可以促进细胞的凋亡已有以下报道：Kwonseop Kim等发现过表达 β-catenin将会诱导小鼠胚胎成纤维细胞的不同程度的凋亡，Marc S.Raab等发现过表达 β-catenin将会诱导MM和HeLa细胞的凋亡。

关于β-catenin是通过何种机制诱导细胞凋亡的争论比较大，一些研究认为p53信号通 路，p14ARF，cyclinD1，而一些研究认为LEF-1和细胞周期蛋白G1没有参与β-catenin诱 导的凋亡，最新的研究表明，β-catenin还了能通过c-Jun/p73调节一些肿瘤细胞的凋亡。 而关于β-catenin是通过何种机制在卵巢颗粒细胞里诱导凋亡还不清楚。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备 促进细胞凋亡的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种促进颗粒细胞凋亡的方法。

本本发明的目的可通过如下技术方案实现：

Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用。

优选所述的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备促进颗粒细胞凋亡的药物中的应用。

其中，所述的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂优选β-catenin的siRNA。

进一步优选正义链序列为SEQ ID No.1，反义链序列为SEQ ID No.2的β-catenin的siRNA， 用β-catenin-siRNA表示。

一种促进颗粒细胞凋亡的方法，是用正义链序列为SEQ ID No.1，反义链序列为SEQ ID No.2 的β-catenin的siRNA转染颗粒细胞。

其中siRNA浓度优选75nM，转染时间优选36h。

有益效果：本发明针对β-catenin基因设计化学合成β-catenin-siRNA，通过脂质体转 染颗粒细胞以敲减猪卵巢颗粒细胞内的β-catenin基因。经过多次实验摸索，确定了最有效 干扰链，以及干扰浓度为75nM，作用时间为36小时。利用Annexin-V/PI双染流式细胞仪测 定75nM β-catenin-siRNA转染颗粒细胞时，转染效率为64.49％。并通过荧光定量PCR和 Westen blot检测转染β-catenin-siRNA36小时后β-catenin基因mRNA和蛋白表达量，来 进一步确认β-catenin-siRNA的干扰效率。结果显示，同空白对照组相比FAM-siRNA转染组 β-catenin基因mRNA表达水平下调59.93％，蛋白水平下调，差异显著(P＜0.05)，而阴性对照 组差异不显著。由此可以说明β-catenin-siRNA能够有效地抑制β-catenin基因的表达，从 而抑制Wnt/β-catenin信号通路。利用Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测转染 β-catenin-siRNA的颗粒细胞的凋亡情况，结果显示，当β-catenin表达被抑制后，与空白 组相比，实验组凋亡细胞数明显增加由8.80％上升到15.85％，差异显著(P＜0.05)。说明 β-catenin-siRNA作为Wnt/β-catenin信号通路抑制剂，能够促进颗粒细胞的凋亡。Bax和 BCL-2分别属于BCL-2家族的原凋亡基因和抗凋亡基因，是线粒体凋亡通路中的主要调节者。 本发明利用real time RT-PCR验检测两个跟凋亡相关的基因Bax和BCL-2在β-catenin诱 导的颗粒细胞凋亡过程中的变化，结果显示，在敲减β-catenin的猪卵巢颗粒细胞里， BCL-2mRNA的表达量下降了44.28％，Bax的mRNA表达量上调了32.76％。

附图说明

图1FAM-siRNA转染颗粒细胞48h荧光显微镜(A)和光镜(B)观察结果(200×)。

图2流式细胞术分析FAM-siRNA转染效率；A：空白对照组；B：FAM转染组。

图3real time RT-PCR检测转染siRNA后β-catenin mRNA的表达变化，数据用means±S.D 表示，每次实验设3个重复，并至少独立实验3次。与空白对照组相比，统计学意义上的显著 差异用*(P＜0.05)表示。

图4Western Blotting检测β-catenin蛋白的表达变化。

图5细胞凋亡散点分布图，A：空白对照组B：NCsiRNA阴性对照组C：β-catenin-siRNA实验 组。

图6沉默β-catenin对细胞凋亡相关基因的表达的影响，差异显著用*表示p＜0.05。

具体实施方式

实施例1

1.1猪卵巢的采集与卵泡的选择

采集新鲜猪卵巢，置于含有庆大霉素的生理盐水，在37℃的环境下运送到实验室，选择 健康的卵巢为实验材料。

1.2颗粒细胞分离及培养

实验之前，将细胞培养基和PBS置于无菌细胞室中的水浴锅中37℃预热，并将实验所需 器材放入细胞间灭菌，培养瓶和高压灭菌过的离心管以及1mL枪头放入超净工作台；将卵巢用 含双抗生理盐水冲洗2次，用PBS清洗3-4次，用酒精棉擦洗两次，选择直径为2-5mm的卵泡 进行颗粒细胞采集；使用带有20g针头的注射器抽取2-8mm直径卵泡的卵泡液及卵泡壁上的颗 粒细胞，并用无菌的钢制滤网(孔径100μm)滤掉其中的卵母细胞，800g离心3min；弃上清， 将余下的颗粒细胞用DMEM/F12培养基清洗一次，再离心(800g，3min)；用DMEM/F12培养基 重悬细胞，0.2％台盼兰染色测定细胞活力。

用DMEM/F12培养基(含10％胎牛血清、青霉素和链霉素)稀释细胞，并以血细胞计数板 计数；将细胞以10⁶个/mL密度接种于培养瓶中，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀，置于37 ℃、5％CO₂的培养箱内培养；细胞每天换一次培养基。

1.3细胞传代

(1)当细胞汇合达75％-95％时，即可对细胞进行传代。

(2)轻轻晃动培养瓶，使瓶内未贴壁的细胞脱落，倒掉培养基。加入2mLPBS缓冲液，轻轻晃动 培养瓶，充分洗去残留的培养基。重复一次。

(3)缓缓向细胞培养瓶内加入1mL0.25％胰蛋白酶(不含0.02％EDTA)消化液，并轻轻晃动，使 胰蛋白酶溶液均匀地覆盖瓶底。

(4)快速将培养瓶放入培养箱1-2min后取出，显微镜下观察，待大多数细胞游离后，立即用 2-3ml含10％胎牛血清的培养基终止消化。

(5)分瓶扩大培养：原代细胞按1∶2-3传代。

1.4siRNA的设计合成

根据GenBank提供的猪β-catenin基因序列(序列号：NM_214367.1)，分别针对964、 854、365位点设计β-catenin的siRNA(命名为β-catenin-siRNA)，不带有荧光标记，分 别称为β-catenin-siRNA-964、β-catenin-siRNA-854、β-catenin-siRNA-365，由上海吉 玛公司化学合成。荧光标记的无义序列为FAM-NC-siRNA。

表1 siRNA序列

1.5细胞转染(以24孔板为例)

参照FuGENEHD Transfection Reagent说明书，使用FuGENEHD Transfection Reagent 说明书推荐的量作为起始点，方法如下：

(1)显微镜下观察细胞达到40-80％的融合度时，给颗粒细胞换无抗生素和无血清的培养基， 置于37℃，5％CO₂培养箱中贴壁24h；

(2)将稀释的5.5uL的FAM-NC-siRNA(20nM)以滴状加入无血清无抗生素培养基总体积为51uL， 为溶液A；

(3)将2uLFuGENEHD转染试剂加入溶液A，注意加的时候要将枪头加到液面以下，得溶液B (转染试剂与FAM-NC-siRNA的V∶m为3∶1)；

(4)将溶液B在室温下混匀的得混合液，静止至少20分钟；

(5)取出培养板，无血清无抗生素培养基冲洗细胞两遍，加入10％无抗生素培养基450uL；

(6)将混合液加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；

(7)置于培养箱中，8小时后更换完全培养基继续培养；

(8)实验分为空白组(不经任何特殊处理)、FAM-NC-siRNA组(转染FAM-NC-siRNA，含FAM标 签)，转染6h后利用荧光显微镜观察是否有绿色荧光，判断转染是否成功，结果见图1。如图 1所示，颗粒细胞发绿色荧光，细胞形态呈梭形或多角形，表明转染成功。

(9)若颗粒细胞发绿色荧光，细胞生长状态良好，则避光用0.25％胰酶消化细胞，用含10％FBS 的DMEM/F12培养基终止消化，离心(2000rpm，5min)弃去培养基；

(10)避光用PBS清洗细胞2次，离心(2000rpm，5min)；

(11)用流式细胞仪测定转染效率，结果表明转染效率为64.49％(图2)。

实施例2 siRNA转染颗粒细胞对β-catenin表达的影响

2.1细胞转染(以24孔板为例)

参照FuGENEHD Transfection Reagent说明书，使用FuGENEHD Transfection Reagent 说明书推荐的量作为起始点，按照以下步骤确定SiRNA的最佳干扰链和它的干扰浓度。

转染方法：

(1)显微镜下观察细胞达到40-80％的融合度时，给颗粒细胞换无抗生素和无血清的培养基， 置于37℃，5％CO₂培养箱中贴壁24h；

(2)将稀释的一定量的siRNA(20nM)以滴状加入无血清无抗生素培养基总体积为51uL，为溶液 A(单孔量，分别以终浓度25、50、75和100nM浓度量计算)；

(3)将2uLFuGENEHD转染试剂加入溶液A，注意加的时候要将枪头加到液面以下，得溶液B (转染试剂与siRNA的V∶m为3∶1)；

(4)将溶液B在室温下混匀，静止至少20分钟；

(5)取出取出培养板，无血清无抗生素培养基冲洗细胞两遍，加入10％无抗生素培养基450uL；

(6)将混合液(4)加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；

(7)置于培养箱中，8小时后更换完全培养基继续培养；

(8)实验分为空白组(不经任何特殊处理)、阴性对照组(转染FAM-NC-siRNA，含FAM标签)、 实验组，实验组又分为12个小组，分别为终浓度25、50、75和100nM浓度的 β-catenin-siRNA-964、β-catenin-siRNA-854、β-catenin-siRNA-365，共计12小组；转 染36h后检测分析。

2.2Real time RT-PCR分析β-catenin mRNA表达的变化情况

2.2.1细胞总RNA提取及cDNA的合成

分别提取2.1中各组转染siRNA的颗粒细胞总RNA，按照英骏公司产品说明书用随机引物 对总RNA进行反转录，将反转录的cDNA产物迅速置于-70℃保存。

2.2.2Real time RT-PCR

(1)20μL反应体系

实时定量PCR 20μL反应体系如下：

(2)使用real time PCR扩增仪进行两步法扩增反应，反应程序为：

使用两步法进行扩增反应，反应程序为：95℃变性10min；95℃15sec，58℃1min， 重复40个循环，每一循环扩增和实时分析；95℃15sec60℃1min，95℃15sec，60℃15sec。

(3)基因定量。

以GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)作为内参照，每个标本重复3次，取平均Ct值，按2- ΔΔCt法分析基因表达情况。mRNA的相对浓度通过公式x＝2-ΔΔCt计算，x代表两个组之 间的起始物质的不同的量，ΔΔCt＝ΔE-ΔC，ΔE＝Ctexp-CtGAPDH exp， ΔC＝Ctcontrol-CtGAPDH control，Ct值代表在一个固定的阈值的条件下目标基因扩增 的量。

表2 引物序列及其产物

利用real time RT-PCR分析β-catenin-siRNA转染36h后β-catenin的表达量，结果 表明，针对964、854、365三位点设计的siRNA中365位点干扰效率最高；当 β-catenin-siRNA-365浓度为75nM时，实验组较空白组β-catenin的表达量下降59.93％ (p＜0.05)，如图3。

2.3Western blot分析β-catenin蛋白表达的影响

2.3.1细胞总蛋白提取

(1)融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF， 使PMSF的最终浓度为1mM；

(2)去除培养液，用PBS将细胞洗2-3遍。按照6孔板每孔加入100-200μl裂解液的比例加 入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就 会被裂解。用细胞刮将培养皿中的细胞刮下收集到离心管中；

(3)充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清置入新的离心管中于-70℃保存。

2.3.2蛋白浓度的测定

(1)取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml 的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

(2)取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml，例如取20μl 25mg/ml蛋白标准， 加入980μl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。用PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml 蛋白标准也可以-20℃长期保存。

(3)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液， 充分混匀。

(4)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释 液补足到20μl。

(5)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。

(6)各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30分钟。

(7)测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

2.3.3Western blot

制作12.5％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，取蛋白样品15ng，上样，以80V电压，分离约2h 后，将所提取的各个蛋白样分别从凝胶转移至PVDF膜，转膜前处理如下：胶条，厚滤纸，PVDF 膜放入转膜液I，一张厚滤纸于转膜液II，以及一张薄滤纸于转膜液III。将PVDF膜于5％脱脂 奶粉溶液室温封闭2h，TBST洗膜3次，每次10min；加入一抗(β-catenin，GAPDH)，4℃过 夜。TBST洗膜后再加入二抗(辣根过氧化物酶羊抗兔IgG)(1∶5000)，室温孵育1h，TBST洗 膜3次，每次10min；最后暗室里ECL发光液混合后作用PVDF膜3min，压X光片1min，X 光片显影和定影。结果表明，365位点干扰效率最高，当siRNA浓度为75nM时， β-catenin-siRNA在颗粒细胞对β-catenin的表达有抑制作用(图4)。

实施例3 siRNA转染颗粒细胞对细胞凋亡及凋亡相关因子的影响

3.1细胞转染：同实施例2，其中实验组siRNA仅为75nM的β-catenin-siRNA-365。

3.2Annexin V/PI双染流式细胞仪测定颗粒细胞凋亡率

(1)β-catenin-siRNA-365转染36h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞；

(2)2000rpm 5min离心收集悬浮细胞；

(3)PBS洗涤细胞两次，2000rpm 5min离心；

(4)加入500uLBinding Buffer悬浮细胞；

(6)加入5ul Annexin V-FITC混匀后，加入Propidium Iodide，混匀；

(7)室温避光反应5-15min；

(8)1h内进行流式细胞仪检测，激发波长Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm，结果见表3，图5。 结果显示：β-catenin-siRNA-365转染组细胞的凋亡率为15.85％，高于空白对照组8.80％， 差异显著(p＜0.05)；空白对照组与阴性对照组相比，凋亡率无明显差异(p＞0.05)。

表3流式分析干扰β-catenin后对颗粒细胞凋亡的影响

3.3Real time RT-PCR检测细胞凋亡相关因子的表达

方法同实施例2之2.2.2，其中使用的引物序列见表4。

表4引物序列及其产物

利用real time RT-PCR分析转染β-catenin-siRNA猪卵巢颗粒细胞内Bcl-2和Bax的表 达量，结果显示，利用β-catenin-siRNA-365敲减β-catenin后，Bcl-2的表达与空白组相 比，下调44.28％(p＜0.05)，相反，Bax的表达上升了32.76％(p＜0.05)(图6)。

本发明实施例涉及的材料如下：

实验动物与样品采集

本研究实验动物为一股商品母猪，由南京天环生猪屠宰场提供。

主要试剂及试剂盒

FuGENEHD转染试剂：Roche公司；细胞凋亡检测试剂盒：凯基公司；DMEM-F12培养干粉： GIBCO公司；新生胎牛血清：民海公司；0.25％胰酶(含EDTA)：GIBCO公司；蛋白裂解液、PMSF、 BCA蛋白浓度试剂盒、ECL发光液：碧云天公司；胶片(Kodak)：Kodak公司；显影粉、定影粉： 温州照相器材公司；PVDF膜：millipore公司；β-catenin抗体：Sigma公司；GAPDH抗体： Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶羊抗兔IgG二抗：Santa Cruz公司；Western用厚滤纸： waterman公司；溴酚兰上样液：生兴科技公司；蛋白MARKER：Fermentas公司；LiCl：Sigma 公司。

溶液配制

NaCl配制：称取1g的NaCl，溶解在20mL纯水中，配制浓度为855mmol/L的储存液，用时加 培养基稀释成25mmol/L。

无血清DMEM/F-12培养液、10％血清无抗生素培养液、10％血清0.25％抗生素培养液、PBS缓冲 液、0.25％胰蛋白酶液等成分及配制方法见附录。

Tris-HCl(pH8.8)：1.5mol/L，18.171g溶于100mL纯水，存放于4℃备用。

Tris-HCl(pH6.8)：1.0mol/L，12.114g溶于100mL纯水，存放于4℃备用。

10％SDS：10g SDS粉溶于100mL纯水，室温存放。

制胶液A液：丙烯酰胺30g，双叉丙烯酰胺0.8g，溶于超纯水，终体积为100mL，用定性滤纸 过滤存于4℃。

制胶液B液：75mL1.5mol/L Tris-HCl，4mL10％SDS，21mL超纯水，终体积为100mL，存于4℃

制胶液C液：50mL1.0mol/L Tris-HCl，4mL10％SDS，46mL超纯水，终体积为100mL，存于4℃

10％过硫酸胺(AP)(W/V)：取100μg过硫酸胺，加入1mL超纯水，使用前新鲜配制。

4％浓缩胶：0.53mLA液，1mLC液，40uLAP液，2.47mL双蒸水，7uLTMEMD

12.5％分离胶：4.17mLA液，2.5mLB液，80uLAP液，3.33mL双蒸水，7uLTMEMD

Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris-Base 25mmol/L，Glycine 250mmol/L，SDS 0.1％，pH8.3。

转膜缓冲液I：7.571gTris，7.505g甘氨酸，250mL10％甲醇，2250mL双蒸水。

转膜缓冲液II：90.855gTris，250mL10％甲醇，2250mL双蒸水。

转膜缓冲液III：7.5725gTris，250mL10％甲醇，2250mL双蒸水。

10×TBS：80g NaCl，2gKCl，30gTris定容至1L，调pH至7.4

TBST(Tris盐含Tween-20缓冲液)：1.65mL 20％Tween-20，700ml 1×TBS，现用现配

抗体封闭液：含有5％BSA或脱脂奶粉的TBST缓冲液。

抗体溶解液：一股可用抗体封闭液溶解抗体。