Clk1缺失通过AMPK/mTORC1信号通路抑制自噬增加多巴胺能神经元死亡

摘要

帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是最常见的神经退行性疾病之一，其特征是黑质致密部多巴胺能神经元进行性减少以及胞内路易士小体的形成。Clk1(coq7)，是辅酶 Q生物合成所必须的线粒体羟化酶，参与线粒体氧化呼吸链中电子传递，将电子从复合物I和复合物II传递到复合物III。本课题旨在探究在PD模型中，Clk1基因在多巴胺能神经元存活中发挥的作用以及作用机制。我们发现，在 MPP+诱导的PD模型中，Clk1缺失会增加多巴胺能神经元的死亡，并且抑制多巴胺能神经元自噬。过表达 Clk1上调多巴胺能神经元的自噬水平。机制研究表明，Clk1通过 AMPK/ mTORC1信号通路调节TFEB的核转录调控多巴胺能神经元自噬。用AMPK激动剂metformin处理可以一定程度减少多巴胺能神经元的死亡。此外，在Clk1+/-小鼠的黑质和纹状体中，检测到自噬相关蛋白水平的降低，以及在MPTP诱导的PD模型中， Clk1+/-小鼠表现出运动障碍的加剧和多巴胺能神经元死亡的增加。并且，用 AMPK激动剂metformin处理可以激活自噬一定程度改善由Clk1缺失造成的MPTP的神经毒性的增加。综上结果表明，Clk1通过AMPK/ mTORC1/TFEB信号通路调控多巴胺能神经元细胞自噬，参与调节多巴胺能神经元死亡。

目录

声明

前言

实验材料和方法

1.实验动物和细胞

2.实验仪器

3.实验试剂

4.实验方法

4.1 溶液配制

4.2细胞培养

4.3 MTT检测

4.4细胞RNA提取及PCR

4.5蛋白免疫印迹 (Western Blot)

4.6细胞免疫荧光

4.7小鼠基因型的鉴定

4.8质粒提取

4.9 Lipofectamine 2000转染质粒

4.10病毒的感染

4.11 小鼠MPTP模型的建立

4.12行为学实验

4.13免疫组织化学

4.14 ADP/ATP比值测定

4.15实验数据处理

实验结果

1. Clk1与多巴胺能神经元存活有关

2. Clk1调控多巴胺能神经元自噬

3. Clk1调控AMPK/mTORC1信号通路

4. Clk1通过AMPK/mTORC1信号通路调控神经元自噬

5. Clk1调控TFEB核转录

6. Clk1+/-小鼠的黑质和纹状体的自噬水平降低

7. 在MPTP诱导的PD模型中，metformin通过促进自噬保护Clk1+/-小鼠的多巴胺能神经元

讨论

结论

参考文献

综述:自噬在帕金森病中的研究进展

附录：缩略词表

致谢