猪流行性腹泻病毒S蛋白不同基因片段重组腺病毒的构建与小鼠免疫特性研究

摘要

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪腹泻和死亡的重要病原之一。目前，虽然商品化PEDV疫苗已普遍使用，但该病在我国仍有流行，并引起严重的经济损失。因此，研制一种新的有效的PEDV疫苗十分必要。 S蛋白是在PEDV的重要结构蛋白，可诱导机体产生中和抗体，是研究PEDV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究利用RT-PCR技术把S基因的三个片段S<,498-638>、S<,1-638>和S<,639-1384>分别克隆入腺病毒表达载体系统中，成功构建了三个重组腺病毒rAd-S<,498-638>、rAd-S<,1-638>和rAd-S<,639-1384>，并在小白鼠体内进行免疫特性研究，为研究PEDV重组腺病毒疫苗奠定基础。 本研究根据GenBank数据库中的PEDV基因序列(No.AY653204)设计了四条引物P1、P2、P3、P4，其中P1和P3分别含有KpnI酶切位点和起始密码子ATG，P2和P4分别含有XhoI酶切位点和终止密码子TAA、TGA。其中引物P1和P2用于扩增s蛋白核心抗原基因第498-638位的氨基酸的基因片段S<,498-638>，P3和P2用于扩增S蛋白的第1-638位氨基酸的基因片段S<,1-638>，P1和P4用于扩增S蛋白第639-1384位氨基酸的基因片段S<,639-1384>，通过RT-PCR技术从国内分离的PEDV JS株中分别扩增获得大小为426bp，1917bp，2661bp的PCR产物，经纯化后与穿梭载体pShuttle-CMV同时进行双酶切，分别经回收后连接。连接产物转化DH5a，然后在卡那霉素抗性(Kan<'r>)平板上挑取阳性菌落，37℃过夜培养。提取质粒经KpnI和XhoI双酶切鉴定，结果所克隆的片段与预期片段大小相符；DNA测序分析结果表明，所插入的基因片段阅读框完全正确，3个基因片段基因序列和PEDV JS株的S基因片段的对应序列的同源性分别为98.6％，97.4％，98.4％。将鉴定正确的重组质粒pShuttle-CMV-S<,498-638>、pShuttle-CMV-S<,1-638>和pShuttle-CMV-S<,639-1384>分别用PmeI进行线性化，然后电转化进含有骨架载体pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞中，经过同源重组，在具有卡那霉素的LB平板上筛选阳性菌落，然后利用PacI对重组质粒进行酶切鉴定，结果与预计的相符，阳性重组质粒分别命名为pAd-S<,498-638>，pAd-S<,1-638>，pAd-S<,639-1384>；经鉴定后，将三个重组质粒大量提取，PacI酶切线性化，阳离子脂质体法转染到HEK293A细胞，于37℃培养7天后出现细胞病变，收获病毒。经噬斑纯化，用间接免疫荧光试验(IFA)鉴定三个重组腺病毒s基因片段的表达，结果表明重组腺病毒中的三个蛋白基因能够在HEK293A细胞中转录和表达，分别命名为rAd-S<,498-638>，rAd-S<,1-638>，rAd-S<,639-1384>。将重组病毒在293细胞上连续传代至20代，每传5代测定病毒滴度一次，其滴度稳定TCID<,50>分别为10<'-6.29>/ml、10<'-5.75>/ml、10<'-6.5>/ml。将100只18-20g的雌性小白鼠随机分为5组，每组20只。第1、2和3组分别免疫三个重组腺病毒rAd-S<,498-638>，rAd-S<,1-638>和rAd-S<,639-1384>，第4、5分别免疫野生型腺病毒(wtAd)和PBS以作为阴性对照和空白对照。通过皮下注射途径分别进行免疫。首免后间隔14d加强免疫一次，共免疫两次。分别于首次免疫后14、28、42、56d，每组随机取出5只小鼠采血测定EuSA抗体，并取小鼠脾通过MTT法进行淋巴细胞转化试验。首免后42d的小鼠血清每组取3份测定中和抗体。结果显示：在三个免疫组的小白鼠血清均能够检测到一定水平的EusA特异性IgG和病毒特异性中和抗体，且在二免后28天(即首免后42天)其OD<,450>值均能达到一个最高值，其中rAd-S<,498-638>所产生的ELISA抗体和中和抗体均最高，另外两组则较低。但这三个重组腺病毒均不能使免疫小鼠的淋巴细胞转化值增高。 综上所述，本研究成功构建了3株重组腺病毒，能够稳定表达PEDV S蛋白的三个片段，TCID<,50>分别为10<'-6.29>/ml、10<'-5.75>/ml、 10<'-6.5>/ml。小白鼠免疫试验证实，三个重组腺病毒均具有PEDV免疫原性。从而为PEDV基因工程疫苗的研究奠定了重要基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章猪流行性腹泻病毒研究进展

1病原学

1.1病毒的形态

1.2分类地位

1.3理化特性

1.4细胞培养特性

1.5基因组结构

2流行病学

3发病机制

4临床特征与病理变化

4.1临床症状

4.2病理变化

5诊断

6防制

7 PEDV疫苗

参考文献

第二章腺病毒载体的特点及其在疫苗研究中的应用

1.腺病毒载体概况

1.1腺病毒的分子生物学特性

1.2腺病毒载体的优点和缺点

2腺病毒载体在疫苗中的应用

2.1腺病毒载体在人载体疫苗研究中的应用

2.2腺病毒载体在动物载体疫苗研究中的应用

参考文献

第三章PRRSV S蛋白基因片段重组腺病毒的构建与鉴定

摘要

引言

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1目的基因的克隆

2.2 DNA测序与分析

2.3 pShuttle-CMV-S基因片段与pAdeasy-1重组

2.4腺病毒重组质粒的鉴定

2.5线性化后的重组质粒转染293细胞

2.6 IFA检测目的基因的表达

2.7重组病毒的克隆及稳定性试验

3.讨论

4.结论

5.参考文献

第四章表达PEDV S蛋白不同片段重组腺病毒小鼠免疫特性研究

摘要

引言

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1小鼠血清特异性ELISA抗体检测

2.2小鼠血清中和抗体检测

2.3小鼠脾淋巴细胞转化试验

3.讨论

4.结论

参考文献

全文总结

后继工作

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文