富硒绿茶功能成分的抗氧化和抗肿瘤作用及其机理研究

摘要

本文基于绿茶具有抗氧化活性和抗肿瘤功能以及植物性来源的硒具有的化学防癌作用，以绿茶作为硒载体，制备富硒绿茶，以现代生物活性物质分离技术，从富硒绿茶和普通绿茶中提取、分离和制备绿茶功能成分茶多酚、茶多糖、茶蛋白，研究富硒绿茶中茶多酚、茶多糖、茶蛋白、水提物以及普通绿茶中茶多酚、茶多糖、茶蛋白、水提物及其与无机硒化合物的混合物的抗氧化活性，筛选出具有高抗氧化活性的组分或组合。采用生物学前沿技术和手段，建立人肝癌HepG2肿瘤细胞培养模型，研究高活性成分的体外抗肿瘤作用及其机理。主要研究结果如下： 1．富硒绿茶理化指标分析表明，硒能显著提高绿茶的感官品质，汤色增加，苦涩味下降；游离氨基酸和蛋白质含量显著提高，茶多酚和叶绿素含量则没有显著差异。按照不同组分的提取工艺，获得的富硒绿茶粗茶多酚中茶多酚含量为841.1±6.8 g kg<'-1>，富硒绿茶粗茶多糖中茶多糖含量为403.0±14.2 g kg<'-1>，富硒绿茶粗茶蛋白中蛋白质含量为624.9±26.7 g kg<'-1>。除蛋白质以外，各种成分与相对应的普通绿茶成分无显著性差异(P>0.05)。 2．采用AAPH和DPPH两种抗氧化体系研究富硒绿茶和普通绿茶不同组分及水提物的抗氧化活性。结果表明，富硒绿茶功能成分和水提物的抗氧化活性高于普通绿茶。AAPH法结果显示，富硒绿茶和普通绿茶不同组分抗脂质过氧化能力由高到低的顺序为：粗茶蛋白>粗茶多酚>粗茶多糖。DPPH法结果显示，富硒绿茶和普通绿茶不同组分清除自由基能力的顺序为：粗茶多酚>粗茶蛋白>粗茶多糖。测定富硒绿茶水提物及不同组分EC<,50>值，水提物为22.43±0.13μgmL<'-1>，粗茶多酚为4.03±0.01μg mL<'-1>，粗茶多糖为273.33±8.66μg mL<'-1>，粗荼蛋白为38.36±2.94μg mL<'-1>，阳性对照a-生育酚为16.65±5.34μg mL<'-1>。富硒绿茶粗茶多酚和粗茶多糖清除自由基能力显著高于普通绿茶粗茶多酚和粗茶多糖，而粗茶蛋白之间没有显著性差异。 3．采用硅胶柱层析法，纯化得到富硒绿茶中茶多酚，其主要儿茶素单体EGCG含量为50.93％，硒含量为0.29±0.012 mg kg<'-1>，显著高于普通绿茶中茶多酚EGCG含量46.90％，硒含量0.052±0.018 mg kg<'-1>。富硒绿茶水提物中EGCG含量为12.39％，硒含量为4.030±0.005 mg kg<'-1>，显著高于普通绿茶水提物EGCG含量11.65％，硒含量0.037±0.002 mg kg<'-1>。富硒绿茶中茶多酚及水提物的抗氧化活性显著高于普通绿茶中荼多酚及水提物以及普通绿茶中茶多酚及水提物与亚硒酸钠之间简单的加合。 4．抗肿瘤作用结果表明，富硒绿茶中茶多酚及水提物、普通绿茶中茶多酚及水提物、普通绿茶中茶多酚及水提物加亚硒酸钠等不同组合对人肺癌细胞A549(50μgmL<'-1>-200μg mL<'-1>)和人肝癌细胞HepG2(200μgmL<'-1>-1000μg mL<'-1>)均有明显的生长抑制作用，并呈剂量．效应关系。富硒绿茶中茶多酚及水提物抑制作用显著高于普通绿茶中茶多酚及水提物与亚硒酸钠的组合。富硒绿茶中茶多酚及水提物对人肝癌细胞HepG2的IC<,50>分别为109.16±0.17μg mL<'-1>和217.88±0.26μg mL<'-1>，富硒绿茶中茶多酚的抑制作用强于富硒绿茶水提物。 5．可见和荧光染色结果表明，富硒绿茶中茶多酚作用于人肝癌HepG2细胞后，细胞变小，胞膜皱缩，细胞核固缩，致密浓染并伴有核型的不规则变化，出现核碎裂等凋亡的典型特征，表明富硒绿茶中茶多酚可明显诱导人肝癌细胞HepG2细胞凋亡。相同剂量下，富硒绿茶中茶多酚对人肝癌细胞HepG2的损伤作用强于富硒绿茶水提物。 6．流式细胞术检测富硒绿茶中茶多酚对人肝癌HepG2细胞周期的影响，结果表明，250μg mL<'-1>的富硒绿茶中茶多酚处理人肝癌细胞HepG2 24 h后，早期凋亡及晚期凋亡的细胞分别占总检测数的14％及1.6％，明显高于未给药对照组1.8％和0.2％，相同浓度的富硒绿茶中茶多酚可使人肝癌细胞HepG2的细胞周期阻滞在S期(对照组为24.59％，给药组为52.49％)，阻断细胞周期向G2-M期进行，阻止细胞增殖，诱导细胞凋亡。 Western blots免疫印迹法检测富硒绿茶对人肝癌细胞HepG2的Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，结果表明，在500 μg mL<'-1>剂量下，富硒绿茶中茶多酚可下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达并促进凋亡诱导基因：Bax的表达，Bax/Bcl-2比值为1.14，明显高于对照0.75；富硒绿茶水提物并无明显下调Bcl-2表达的作用，但在5μg mL<'-1>时，具有促进凋亡诱导基因Bax表达的作用，Bax/Bcl-2比值为1.49，明显高于对照1.07。

目录

文摘

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声明

第一章文献综述

1.茶叶功能成分研究

1.1茶叶的作用与地位

1.2茶叶的生物活性成分及其功能

2.硒的化学形态与生物活性研究

2.1硒的地位和作用

2.2硒的抗肿瘤作用

2.3硒的存在形式及代谢途径

3富硒茶叶研究

3.1硒对茶叶品质的影响

3.2富硒绿茶生物活性研究

4本研究的目的、意义及主要内容

4.1本研究目的与意义

4.2本研究的主要内容

第二章富硒绿茶中茶多酚、茶多糖和茶蛋白的制备及其抗氧化活性研究

1材料与方法

1.1富硒肥料制备

1.2富硒绿茶制备

1.3主要试剂

1.4主要仪器

1.5富硒绿茶中茶多酚、茶多糖、茶蛋白和水提物的制备

1.6绿茶品质测定

1.7富硒绿茶抗氧化活性测定

1.8实验数据的分析与处理

2结果与分析

2.1硒对绿茶理化品质的影响

2.2富硒绿茶中粗茶多酚、茶多糖、茶蛋白和水提物的制备

2.3富硒绿茶中粗茶多酚、茶多糖、茶蛋白和水提物的抗氧化活性

2.4硒对富硒绿茶抗氧化活性的影响

3讨论

4本章小结

第三章富硒绿茶中茶多酚及水提物的In vitro抗氧化和抗肿瘤活性研究

1材料与方法

1.1主要化学试剂

1.2实验仪器及设备

1.3细胞系

1.4实验方法

1.5实验数据的分析与处理

2结果与分析

2.1富硒绿茶中茶多酚的柱层析分离

2.2富硒绿茶中茶多酚及水提物的儿茶素单体组成

2.3富硒绿茶中茶多酚及水提物的含硒量分析

2.4富硒绿茶中茶多酚及水提物的体外抗氧化活性

2.5富硒绿茶中茶多酚及水提物的体外抗肿瘤活性

3讨论

4本章小结

第四章富硒绿茶中茶多酚诱导人肝癌细胞HepG2凋亡机理研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2主要试剂

1.3仪器及设备

1.4实验方法

2结果与分析

2.1台盼蓝染色检测细胞活力

2.2光镜观察富硒绿茶对人肝癌HepG2的损伤作用

2.3 DAPI染色检测富硒绿茶对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导作用

2.4 Annexin V/PI双染流式细胞术检测富硒绿茶中茶多酚对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导作用

2.5流式细胞仪检测富硒绿茶中茶多酚对人肝癌细胞HepG2细胞周期的影响

2.6 Western blots免疫印迹法检测富硒绿茶对Bcl-2、Bax表达的影响

3讨论

4本章小结

5工作展望

全文结论

论文创新点

参考文献

致谢

攻读学位期间发表与投稿论文