大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因转化大豆初步研究

摘要

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的特异性序列的转录后基因沉默。大豆种子的储藏蛋白基因的表达调控主要发生在转录水平和转录后水平上。提高11S球蛋白的含量或降低7S球蛋白的含量可改善大豆蛋白的功能特征和营养品质，却不会改变总蛋白质和脂肪的含量。因此，本实验以β-伴大豆球蛋白α亚基基因为靶基因设计RNA干扰载体，并将其转化大豆，探究此基因对提高种子中含硫氨基酸的贡献，推测大豆11S与7S的调控机制。本实验对该基因进行了以下几个方面的研究:
　　首先，根据大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因序列(GenBank No.AB 051865)同大豆基因组数据库的比对结果，初步认定，该基因在大豆基因组中具有两个拷贝，这两个拷贝都位于第20号染色体上，分别对应Glyma20g28650和Glyma20g28660。这两个拷贝在编码区上都包含6个外显子与5个内含子，ORF完全相同，且都编码605个氨基酸。用7Sα基因编码的氨基酸序列与同源基因绘制的进化树表明，与苜蓿(Mt)的亲源关系最近，与毛果杨(Pt)的亲源关系最远。在7Sα基因表达形成的蛋白质的N端检测到跨膜结构和信号肽。
　　根据Gm7Sα基因的特点，借助Gateway方法，构建了该基因的干扰载体(简写为pBI-Gm7SαRi)。在对农杆菌介导的大豆子叶节的遗传转化体系中灭菌时间，标记基因的筛选压进行优化后，用构建好的干扰载体对组培性状良好的大豆品种进行了转化。最终获得了71株转化苗，T0代收获种子161粒，播种于大田后，由于鸟害等的影响，成活65株。除对转化苗的表型进行观察外，还做了进一步的实验研究，即对T1代进行除草剂涂抹实验，叶片的PCR检测以及荧光定量确定拷贝数等多种方法对转化苗进行检测后，确定了20株阳性转基因植株，其中南农88-1有13株，Jack有7株。
　　高代RNAi-Gm7Sα转基因植株采用系谱法对后代进行选择。选择优良单株，收获种子后点播成行。分别对转基因后代进行分子检测和氨基酸含量测定，发现Gm7Sα表达受到抑制的后代植株中，其种子中含硫氨基酸含量也会提高。

目录

声明

摘要

缩略词表及其英汉对照

第一章 文献综述

1 大豆种子蛋白的研究进展

1．1 大豆贮藏蛋白的分类

1．2 大豆种子贮藏蛋白基因

1．3 7S亚基基因的研究进展

2 改变大豆氨基酸组成方法的研究进展

2．1 内源蛋白基因的改造和调控

2．2 导入异源基因

2．3 诱变技术利用

3 RNAi技术及作用机制

3．1 RNAi研究的发展历史

3．2 RNAi的研究进展

3．3 RNAi技术的特征

3．4 RNA干涉技术的的应用

3．5 应用RNA干涉技术构建高效植物干扰载体

4 大豆遗传转化的研究

4．1 大豆遗传转化体系的研究

4．2 大豆遗传转化相关基因

5 研究的目的和意义

第二章 大豆Gm7Sα基因的生物信息学分析及干扰载体的构建

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

1．2 实验方法与过程

2 结果与分析

2．1 Gm7Sα基因序列相关生物信息学分析

2．2 Gm7Sα干涉片段的克隆

2．3 利用Gateway技术构建RNAi干涉载体

2．4 植物干扰表达载体转化根癌农杆菌的检测7

3 讨论

第三章 农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

1．2 实验方法与过程

2 结果与分析

2．1 大豆的转化及再生

2．2 转化植株的获得

2．3 转化植株的叶片涂抹检测

2．4 转化植株的叶片的PCR检测

2．5 转基因植株的荧光定量拷贝数结果

2．6 转基因植株的表型观察

3 讨论

3．1 大豆遗传转化影响因素

3．2 抗性植株的检测

第四章 高代转基因大豆检测

1 材料与方法

1．1 实验材料与仪器

1．2 方法与步骤

2 结果与分析

2．1 高代转基因大豆植株含硫氨基酸和自由氨基酸含量测定

2．2 高代转基因大豆的PCR检测

2．3 高代转基因大豆的半定量分析

2．4 高代转基因大豆植株含硫氨基酸和自由氨基酸含量测定

3 讨论

全文结论

本研究创新之处

参考文献

附录

致谢