鼠李糖乳杆菌fmb-9产抑菌物质的研究及其培养基优化

摘要

乳酸菌在自然界中大量存在，是最常见的益生菌之一，被广泛应用在食品生产、医疗保健和饲料工业中。乳酸菌能够产生多种生物活性物质，包括细菌素、有机酸和多种酶类，这些活性物质中很多都具有抑菌能力。随着社会的进步和生活水平的提高，人们对于食品安全的要求也越来越高。目前普遍使用的食品添加剂主要是化学添加剂，这类物质的大量使用严重影响着人体的健康。因此，寻找安全、稳定、高效的抑菌物质是目前食品添加剂的主要研究方向。乳酸菌作为一种益生菌，它所产生的抑菌物质是被公认安全的，使用这类物质作为食品添加剂，将会极大的提高我国食品的安全性。
　　乳酸菌fmb-9是本实验室保藏的一株具有抑菌能力的菌株，分离自泡菜中。本研究旨在对乳酸菌fmb-9进行筛选活化和分类鉴定，并分析它所产生抑菌物质的理化性质，初步研究分离纯化方法，最后优化菌株产抑菌物质的培养基，为进一步开发利用天然抑菌物质提供理论基础。具体研究结果如下:
　　1.对保藏的乳酸菌fmb-9进行活化和复壮，并对复壮的菌株进行分类鉴定。菌落形态观察具有典型的乳酸菌特征，革兰氏染色镜检显示阳性，生理生化特性研究初步确定菌株属于乳酸杆菌。在分子生物学鉴定中，通过总基因组提取、PCR扩增，得到长度为1437bp的16SrDNA序列，与GenBank中相关序列进行同源性比对后，根据研究结果构建系统发育树，并对菌株进行了系统发育分析，结果显示菌株fmb-9的16SrDNA序列和数据库中多株菌的序列同源性达到99％以上，确定菌株属于鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）。
　　2.抑菌实验结果表明，乳酸菌fmb-9产生的抑菌物质具有较广的细菌抑菌谱，能够抑制短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌等致病菌，但对真菌没有抑制效果。生长曲线测定结果表明，菌株生长4h进入对数期，16h进入稳定期;发酵中培养基pH值持续下降，最终稳定在pH3.8;菌株发酵2h即开始产生抑菌物质，36h左右抑菌活性达到最高。抑制排除实验和蛋白酶敏感性实验证明，发酵液的抑菌活性与有机酸和过氧化氢无关，抑菌物质对胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K均有一定的敏感性，推测该物质可能具有蛋白特性。稳定性实验证明，抑菌物质对于温度、pH值、紫外线均有很好的耐受性，其抑菌活性显现范围为pH2.0-5.0，在pH值大于5.0的环境中将失去抑菌能力。
　　3.分离纯化实验证明，酸沉、萃取和层析柱分离对乳酸菌fmb-9产生的抑菌物质均有较好的纯化效果。抑菌物质在pH2.0处不被沉降;该物质易溶于甲醇中，基本不能被正己烷和乙酸乙酯溶解;葡聚糖凝胶柱层析能够有效分离抑菌物质。初步的分离流程为:首先调节发酵液为pH2.0进行酸沉，其次使用正己烷和乙酸乙酯萃取，对萃余液进行浓缩后采用甲醇复溶，溶液经葡聚糖凝胶柱层析分离。抑菌物质的最大吸收峰在222nm处，通过HPLC分析认为该物质具有较大的极性。
　　4.选择番茄培养基1号作为初始培养基。通过培养基组分筛选，选出最合适的发酵材料为番茄汁、土豆汁、玉米汁，最适碳源为葡萄糖，最适氮源为大豆蛋白胨。通过单因素实验、关键因素筛选实验选出葡萄糖和大豆蛋白胨两个关键因素。根据最陡爬坡实验、中心组合实验、响应曲面分析，确定培养基各组分的最佳用量分别为:葡萄糖50.74g/L，大豆蛋白胨47.80g/L，番茄汁10ml/L，土豆汁20ml/L，玉米汁10ml/L，吐温801.0ml/L，磷酸氢二钾0.5g/L，此时抑菌圈直径达到13.55mm，比优化前提高了15.80％。

目录

声明

表格索引

图形索引

摘要

第一章 文献综述

1 乳酸菌的定义及分类

1．1 乳酸菌的定义

1．2 乳酸菌的分类

2 乳酸菌产生的抑菌物质

2．1 乳酸菌产生的细菌素

2．2 乳酸菌产生的其它抑菌物质

2．3 我国乳酸菌抑菌物质研究进展

3 乳酸菌发酵培养基

3．1 培养基成分对抑菌物质产生的影响

3．2 食品培养基研究进展

4 本研究的目的意义及内容

参考文献

第二章 乳酸菌fmb-9的活化复壮和菌种鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 乳酸菌fmb-9的菌株活化与活性检测

2．2 乳酸菌fmb-9的初筛

2．3 乳酸菌fmb-9的复筛

2．4 乳酸菌fmb-9的鉴定

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 乳酸菌fmb-9产抑菌物质的理化性质和初步分离研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 乳酸菌fmb-9产抑菌物质的理化性质测定

2．2 乳酸菌fmb-9产抑菌物质的初步分离

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 乳酸菌fmb-9培养基优化研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 初始培养基筛选

2．2 培养基组分筛选

2．3 单因素实验

2．4 关键因素筛选实验结果

2．5 最陡爬坡实验结果

2．6 响应曲面结果分析

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

创新点

致谢