Bacillus subtilisJ-4菌株产抑菌物质发酵条件优化及粗提物稳定性研究

摘要

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)J-4菌株是从健康肉鸡粪便中分离得到的益生菌株，具有防治畜禽腹泻、促进畜禽生长的作用。J-4菌株能产生抑制大肠杆菌等腹泻病原菌的胞外抑菌物质，该抑菌物质具有开发成为饲料添加剂的潜力。本研究优化了J-4菌株产生抑菌物质的发酵条件，对抑菌物质进行初步分离，获得其粗提物，并对粗提物抑菌活性的稳定性进行了初步研究。
　　通过单因素试验和正交试验对J-4菌株产抑菌物质条件进行优化，最终确定最佳培养条件为发酵温度37℃、装液量100mL(250mL)、接种量5％及发酵周期36h;最佳发酵培养基组成为葡萄糖1.00％、黄豆饼粉1.00％、MgSO40.15％和Na2HPO4-NaH2PO40.10％。优化后，J-4菌株产生的抑菌物质对应的抑菌面积比基础发酵培养基对应的抑菌圈面积增大50.25％。
　　通过比较乙醇、丙酮沉淀，乙酸乙酯、乙醚和三氯甲烷萃取，硫酸铵盐析等方法对J-4菌株发酵上清液抑菌物质的提取效果，确定硫酸铵盐析法是初步分离该抑菌物质的最佳方法。盐析的最佳硫酸铵浓度为60％饱和度，并通过截留分子量为8-10KD的透析膜透析，薄膜浓缩和冷冻干燥制备了该抑菌物质的粗提物。
　　以含粗提物1.0mg/mL的溶液为对象，研究了温度、pH、蛋白酶、有机溶剂、阴阳离子及表面活性剂等对抑菌物质活性的影响。在60℃或100℃条件下保温20min，粗提物水溶液的抑菌活性基本不变，在121℃下保温5min只能保持约50％的抑菌活性;在pH2.0～pH7.0范围内随着pH的升高，粗提物表现出的抑菌活性越强，超过pH7.0抑菌活性也随之降低;粗提物溶液被100mg/mL的胃蛋白酶处理30min后，仍保持85％以上的抑菌活性，且对胰蛋白酶稳定;SDS能明显降低粗提物的抑菌活性，达到35mg/mL以上时，抑菌活性完全丧失;随EDTA浓度的增大，抑菌物质的活性逐渐降低;吐温80和β-巯基乙醇对粗提物抑菌活性没有影响。乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷和苯等7种有机溶剂对粗提物的抑菌活性基本没有影响。阳离子Ca2+和K+对粗提物的抑菌活性有促进作用，Na+和Mg2+对抑菌物质的抑菌活性基本无影响，Mn2+对抑菌物质的抑菌活性有一定的抑制作用;阴离子Cl-对粗提物的抑菌活性基本没有影响，SO42-、NO3-、HCO3-和H2PO4-对抑菌活性均有一定的抑制作用。
　　总之，在优化发酵条件，提高了抑菌物质发酵活性的基础上，确定了获得粗提物的方法，并对粗提物活性的影响因素进行了研究。为该抑菌物质的进一步深入研究及利用该抑菌物质研制饲料添加剂奠定了基础。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 枯草芽孢杆菌产抑菌物质种类

1．1．1 脂肽类

1．1．2 抑菌蛋白类

1．2 枯草芽孢杆菌产抑菌物质发酵条件优化研究

1．2．1 正交试验法优化发酵条件

1．2．2 响应面法优化发酵条件

1．3 枯草芽孢杆菌抑菌物质的粗提

1．3．1 有机溶剂提取

1．3．2 等电点沉淀

1．3．3 盐析法

1．4 枯草芽孢杆菌抑菌物质稳定性研究

1．4．1 温度稳定性

1．4．2 酸碱敏感性

1．4．3 金属离子对抑菌活性的影响

1．4．4 有机溶剂对抑菌活性的影响

1．4．5 蛋白酶对抑菌活性的影响

1．4．6 表面活性剂等的影响

1．5 本研究的目的意义

第2章 枯草芽孢杆菌J-4菌株产抑菌物质发酵条件优化

2．1 材料与方法

2．1．1 菌种和培养基

2．1．2 试验仪器

2．1．3 J-4菌株种子液的制备

2．1．4 病原指示菌平板的制备

2．1．5 J-4菌株抑菌物活性测定

2．1．6 J-4菌株产抑菌物质培养条件优化

2．1．7 培养基单因素试验

2．1．8 培养基组成的正交试验

2．2 结果与分析

2．2．1 J-4菌株培养条件试验

2．2．2 培养基成分单因素试验

2．2．3 培养基组成的正交试验

2．3 小结

第3章 J-4菌株胞外抑菌物质提取

3．1 材料与方法

3．1．1 菌种和培养基

3．1．2 仪器及试剂

3．1．3 发酵上清液的制备

3．1．4 病原指示菌平板制作

3．1．5 抑菌活性的测定

3．1．6 乙醇沉淀法

3．1．7 丙酮沉淀法

3．1．8 有机溶剂萃取法

3．1．9 硫酸铵盐析法

3．2 结果与分析

3．2．1 乙醇沉淀

3．2．2 丙酮沉淀

3．2．3 有机溶剂萃取

3．2．4 硫酸铵盐析

第4章 枯草芽孢杆菌J-4菌株胞外抑菌物质稳定性研究

4．1 材料与方法

4．1．1 菌种和培养基

4．1．2 仪器及试剂

4．1．3 发酵上清液的制备

4．1．4 病原指示菌平板制备

4．1．5 抑菌物活性测定

4．1．6 最适盐析饱和度试验

4．1．7 J-4抑菌物质粗提物的制备

4．1．8 粗提物抑菌活性测定

4．1．9 抑菌物质对温度的稳定性

4．1．10 抑菌物质对pH的敏感性

4．1．11 对蛋白酶的敏感性

4．1．12 表面活性剂等对抑菌活性的影响

4．1．13 有机溶剂对抑菌活性的影响

4．1．14 常见离子对抑菌活性的影响

4．2 结果与分析

4．2．1 硫酸铵最适盐析饱和度

4．2．2 粗提物浓度对抑菌的影响

4．2．3 抑菌物质对温度的稳定性

4．2．4 pH对抑菌物质活性的影响

4．2．5 对蛋白酶的敏感性

4．2．6 表面活性剂等对抑菌活性的影响

4．2．7 有机溶剂对抑菌活性的影响

4．2．8 常见离子对抑菌活性的影响

4．3 小结

4．4 讨论

参考文献

在读期间发表论文

作者简历

致谢