NaCl及其联合Ca2+处理下发芽大豆生理变化与GABA富集调控机理

摘要

大豆（Glycine max L.）富含蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养物质。大豆籽粒发芽期间，内源酶系统被激活，蛋白质等贮藏性物质分解生成易于吸收利用的小分子物质，抗营养因子减少，尤其具有多种生理作用的γ-氨基丁酸(GABA)等功能性物质得以富集。高等植物中GABA主要由GABA支路和多胺降解途径合成，其中谷氨酸脱羧酶(GAD，EC4.1.1.15)、二胺氧化酶(DAO，EC1.4.3.6)、多胺氧化酶(PAO，EC1.5.3.3)和氨基醛脱氢酶（AMADH, EC1.2.1.19）是这两条途径中合成GABA的关键酶。植物在逆境胁迫条件下GABA合成酶激活，GABA大量积累。Ca2+对缓解植物非生物胁迫以及GABA的积累起重要作用。本文研究从生理代谢水平、酶水平、基因水平和蛋白质水平探讨NaCl及其联合Ca2+调控发芽大豆GABA富集机制。主要研究结果如下:
　　1、研究了NaCl胁迫对发芽大豆生理代谢和GABA富集的影响。NaCl胁迫下，发芽大豆生长受到抑制，芽长、呼吸速率、干物质含量以及单株发芽大豆与其子叶和胚的干、鲜重均显著下降;子叶和胚中丙二醛和H2O2含量显著增加;可溶性蛋白含量增加而游离氨基酸含量降低;超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力无显著变化(p＞0.05)，胚中过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力均显著提高;NaCl胁迫显著影响大豆可溶性糖和脯氨酸含量;NaCl胁迫下，发芽大豆子叶和胚中GAD、DAO、PAO和AMADH活力均显著提高，且胚中GAD和DAO活力显著高于子叶(p＜0.05)，发芽4d时子叶和胚中GABA含量分别是对照（未胁迫处理）的1.54倍和1.70倍，谷氨酸(Glu)和游离态多胺(fPAs)含量受NaCl胁迫调节。NaCl胁迫基础上施用氨基胍（AG，胺氧化酶抑制剂）显著降低了各部位PAO和AMADH活力(p＜0.05)，DAO活力则完全被抑制，GAD活力无显著变化(p＞0.05)，多胺降解途径被抑制，子叶和胚中GABA含量分别下降31.5％和33.5％;子叶中Glu和fPAs含量均显著增加，胚中Glu含量显著降低而fPAs含量显著增加。NaCl胁迫下多胺降解途径对大豆发芽富集GABA的贡献率大于30％。
　　2、研究了NaCl胁迫下Ca2+对发芽大豆生理代谢和GABA富集的影响。NaCl胁迫下，发芽大豆经CaCl2处理，SOD、CAT、POD和GPX活力显著增加(p＜0.05)，缓解NaCl胁迫对发芽大豆生长的抑制，其芽长、呼吸速率、干物质含量以及单株发芽大豆与其子叶和胚的干、鲜重均显著增加，丙二醛以及H2O2含量显著降低(p＜0.05)，而施用LaCl3（Ca2+通道抑制剂）则呈相反的变化趋势;CaCl2或LaCl3处理后发芽大豆中可溶性糖含量均显著降低，胚中脯氨酸含量亦显著降低;NaCl联合CaCl2处理下，发芽大豆子叶和胚中GAD显著增加，分别是单独NaCl处理中的1.45倍和1.74倍，而各部位DAO、PAO和AMADH活力均显著降低，单株大豆子叶和胚中GABA含量分别为NaCl胁迫处理1.12倍和2.14倍;LaCl2处理显著降低发芽大豆子叶和胚中GAD、DAO、PAO和AMADH活力，GABA含量显著降低;CaCl2或LaCl3处理均显著增加子叶和胚中fPAs含量，降低子叶中Glu含量;在NaCl联合CaCl2或LaCl3基础上施用AG，发芽大豆子叶中GABA含量分别降低17.0％和20.5％，而胚中分别下降11.7％和7.8％。NaCl联合CaCl2处理可缓解NaCl胁迫对发芽大豆生长的抑制，提高生物量和单株大豆GABA含量，同时GABA支路关键酶活力显著提高，抑制多胺降解途径中关键酶活力则显著下降，从而多胺降解途径对GABA富集贡献率下降;NaCl联合LaCl3处理抑制Ca2+对抗氧化酶所起的调控作用，发芽大豆生长停滞并阻碍GABA累积。
　　3、采用RACE(Rapid-amplification ofcDNA ends)技术，设计兼并引物、3'和5'端特异性引物，克隆发芽大豆AMADH基因。将中间片段、上游及下游cDNA序列拼接得到1679 bp的AMADH基因序列（包含部分内含子）。运用DNAStar和BioXM在线软件分析序列，发现AMADH基因序列包含有1515 bp开放阅读框，编码505个氨基酸的多肽序列（GenBank登录号:KC478661），预测分子量为54.79 kDa，等电点pI为5.16。
　　4、研究NaCl及其联合Ca2+对发芽大豆GABA合成酶基因表达的影响。NaCl胁迫下，发芽大豆子叶和胚中GAD、DAO和AMADH表达量均显著上调(p＜0.05);NaCl胁迫基础上施用AG，各部位GAD表达量均无显著变化(p＞0.05)，子叶中DAO和AMADH表达量显著下调(p＜0.05)，而胚中无显著变化; NaCl联合CaCl2处理，发芽大豆子叶中GAD表达量无显著变化(p＞0.05)，DAO和AMADH表达量显著下降，胚中GAD、DAO和AMADH表达量均显著下降(p＜0.05);NaCl联合LaCl3处理抑制GAD和DAO的表达水平;在此基础上抑制多胺降解途径，发芽大豆各部位GAD、DAO和AMADH表达量较单独NaCl胁迫无显著变化(p＞0.05)。NaCl胁迫提高GABA合成酶活力及其基因表达水平，积累GABA; CaCl2处理下，GAD活力的提高由Ca2+刺激所致，与其基因表达无关，CaCl2显著抑制多胺降解途径代谢酶活力及其基因表达，降低其对GABA贡献率;NaCl联合LaCl3处理抑制GAD和DAO酶活力及其基因表达量，阻碍GABA积累;AG对GABA合成酶基因表达无显著影响。
　　5、研究NaCl胁迫下发芽大豆蛋白质组差异表达。NaCl及其联合AG处理下，从发芽大豆子叶和胚中分别成功鉴定出具统计学意义且丰度变化大于1.5倍或小于0.67倍的72个和63个差异表达蛋白。子叶中差异蛋白有62.5％是贮藏蛋白，其余差异蛋白涉及代谢、能量、细胞生长与分裂、蛋白水解、转运以及防御功能，主要定位于细胞质、细胞核、叶绿体、线粒体以及液泡;胚中差异蛋白涉及9个功能分类，包括细胞代谢、能量、细胞生长与分裂、蛋白质合成、蛋白定向与贮藏、蛋白转运、信号转导、防御以及次级代谢，分布于细胞质、细胞核、叶绿体、线粒体、液泡、细胞质骨架以及内质网。NaCl胁迫下，发芽大豆Glu和PAs代谢途径中的蛋白丰度具有显著性变化，其中，NaCl处理显著降低谷氨酰胺合成酶PR-2以及谷氨酰胺合成酶前体的蛋白丰度，而显著提高甲硫氨酸合成酶和5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶丰度，AMADH丰度在NaCl胁迫下同样显著高于对照，从而有利于发芽大豆体内GABA的富集。
　　6、研究NaCl联合Ca2+处理下发芽大豆蛋白质组差异表达。NaCl联合CaCl2或LaCl3处理后共在发芽大豆子叶和胚中成功鉴定出具统计学意义且丰度变化大于1.5倍或小于0.67倍的80和71个差异表达蛋白。鉴定出的差异蛋白主要涉及细胞代谢、能量、细胞生长与分裂、蛋白质合成、蛋白定向与贮藏、蛋白转运、信号转导、防御以及次级代谢等功能，且分布于细胞质、细胞核、叶绿体、线粒体、液泡、细胞质骨架以及内质网。CaCl2处理下，发芽大豆通过加速信号转导、能量代谢以及蛋白转运、促进蛋白合成并抑制蛋白降解、重新动员分配贮藏蛋白、调节内质网蛋白加工过程、强化抗氧化酶系统、富集次级代谢产物以及其它未知的适应性生理调节增强其对于NaCl胁迫的耐受性。NaCl联合CaCl2处理下，发芽大豆中参与Glu代谢的谷氨酰胺合成酶PR-2以及谷氨酰胺合成酶前体的丰度均显著下降;而LaCl3处理后谷氨酰胺合成酶PR-2未检出，谷氨酰胺合成酶前体的丰度显著增加;参与PAs代谢的两个S-腺苷甲硫氨酸合成酶以及甲硫氨酸合成酶经CaCl2处理后其丰度增加，而经LaCl3处理其丰度降低;NaCl联合CaCl2或LaCl3处理调控GABA代谢前体Glu和PAs代谢的同时，CaCl2亦显著提高发芽大豆中AMADH的表达丰度，而LaCl3处理显著降低了其蛋白丰度进而阻碍GABA积累。

目录

声明

摘要

表格索引

图形索引

缩略词表

第一章 文献综述

1 高等植物中GABA代谢途径

1．1 GABA支路

1．2 多胺降解途径

2 高等植物富集GABA的方法

2．1 盐胁迫

2．2 低氧胁迫

2．3 低温胁迫

2．4 高温胁迫

2．5 机械损伤

2．6 其它方法

3 钙与植物生理代谢研究进展

3．1 钙的生理功能

3．2 植物钙信使系统及其在非生物胁迫中的作用

3．3 钙对植物体内GABA积累的影响

4 植物中GABA富集与信号传导和基因表达之间的关系

4．1 信号传导

4．2 GABA富集与基因表达

5 植物非生物逆境胁迫蛋白质组学研究进展

5．1 盐胁迫

5．2 低温胁迫

5．3 高温胁迫

5．4 机械损伤

5．5 其它非生物胁迫

6 本研究目的意义和研究内容

6．1 本研究目的意义

6．2 主要研究内容

参考文献

第二章 NaCl及其联合Ca2+对发芽大豆生理代谢与GABA富集的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要实验仪器设备

1．4 试验方法

1．5 测定指标与方法

1．6 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 NaCl及其联合Ca2+对发芽大豆主要生理生化指标的影响

2．2 NaCl及其联合Ca2+对发芽大豆抗氧化酶活性的影响

2．3 NaCl及其联合Ca2+对发芽大豆GABA富集的影响

3 讨论

3．1 NaCl胁迫对发芽大豆生理代谢及GABA富集的影响

3．2 Ca2+对NaCl胁迫下发芽大豆生理代谢及GABA富集的影响

4 本章小结

参考文献

第三章 NaCl及其联合Ca2+处理下发芽大豆GABA富集的分子调节机制研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 试验方法

1．5 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 大豆AMADH基因cDNA全长克隆及序列分析

2．2 NaCl及其联合Ca2+处理下发芽大豆GABA关键酶基因表达变化

3 讨论

3．1 NaCl胁迫对发芽大豆GABA富集相关基因表达的影响

3．2 NaCl联合Ca2+处理对发芽大豆GABA富集相关基因表达的影响

4 本章小结

参考文献

第四章 NaCl及其联合Ca2+处理下发芽大豆蛋白组差异表达研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 试验方法

1．5 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 NaCl及其联合Ca2+处理下发芽大豆双向电泳

2．2 NaCl胁迫下发芽大豆中蛋白质差异表达分析

2．3 NaCl联合Ca2+处理下发芽大豆中蛋白质差异表达分析

3 讨论

3．1 NaCl胁迫对发芽大豆蛋白组差异表达及其与GABA富集的关系

3．2 NaCl联合Ca2+处理下发芽大豆蛋白组差异表达及其与GABA富集的关系

4 本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文与专利