发芽蚕豆富集GABA的关键酶特性与低氧及其联合NaCl胁迫的调控机理

摘要

蚕豆（ViciafabaL.）籽粒富含蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养物质。在发芽过程中，蚕豆籽粒内源酶系统被激活，蛋白质、碳水化合物等贮藏性物质被分解成易于吸收利用的小分子物质，对人体具有生理作用的γ-氨基丁酸(GABA)等功能性物质生成或得以富集，同时抗营养因子降解。植物中GABA由GABA支路和多胺降解途径合成，其中谷氨酸脱羧酶(GAD，EC4.1.1.15)和二胺氧化酶(DAO，EC1.4.3.6)分别是这两条途径中合成GABA的限速酶。发芽蚕豆在低氧胁迫下激活GAD和DAO，GABA大量积累。Ca2+和脱落酸(ABA)对植物逆境信号的传递起重要作用。本文研究了发芽蚕豆中GAD和DAO酶学特性，揭示了低氧及其联合NaCl胁迫下Ca2+和ABA对GABA富集的影响机制。主要研究结果如下:
　　1、研究了蚕豆发芽过程中GAD及DAO的变化情况以及纯化后的酶学特性。在5d的发芽过程中，GAD活力在胚根中上升较快，且活力最高;DAO活力在胚芽中急剧上升。30℃和酸性条件下发芽更利于提高GAD和DAO活力;氨氧乙酸和氨基胍(AG)分别显著抑制GAD和DAO活力，其抑制率随浓度的增加而提高;6.0mmol/LCaCl2均可提高发芽蚕豆中GAD和DAO活力，而0.5mmol/LEDTA-Na2显著抑制GAD和DAO活力,GAD和DAO可分别被90mmol/L的PLP和CuCl2激活。发芽5d的蚕豆中GAD和DAO经纯化后，SDS-PAGE电泳测得其亚基分子量分别为58kDa及52kDa。两者最适反应温度均为40℃，最适反应pH分别为6.0和6.5。GAD活力被Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ba2+、氨氧乙酸、EGTA、EDTA-Na2、L-半胱氨酸(L-cys)和β-巯基乙醇显著抑制，而被低浓度Ca2+(0.2mmol/L)激活;DAO活力被Mg2+、Cu2+和Fe3+、AG、EGTA、EDTA-Na2、L-cys和β-巯基乙醇抑制。GAD对Glu的Km为2.63mmol/L;DAO对腐胺(Put)和亚精胺(Spd)的Km分别为0.23mmol/L和0.96mmol/L，而对Spm无降解作用。
　　2、研究了蚕豆发芽3d和5d时GABA富集情形。非胁迫发芽时，随发芽时间的延长，蚕豆中GABA含量及DAO无显著变化，GAD活力在发芽5d时显著提高(P＜0.05)，Glu及PAs含量呈上升趋势。低氧胁迫提高了发芽蚕豆GAD和DAO活力，Glu和PAs与GABA含量显著提高(P＜0.05)。当发芽5d时，GABA含量提高了3.27倍，其中子叶和胚中分别提高了1.10及17.14倍。解除低氧胁迫促使GAD活力显著升高和DAO活力显著下降，同时GABA、Glu及PAs含量显著降低(P＜0.05)。低氧胁迫下用AG处理后，DAO活力被抑制，阻止PAs向GABA转化，导致PAs积累。当处理3d和5d时，GABA分别减少了30.30％和30.80％。
　　3、低氧处理和NaCl胁迫对发芽蚕豆GABA的富集具有叠加作用，且达到最高含量的胁迫时间缩短;解除NaCl、低氧处理3d后，GABA含量高于低氧联合NaCl胁迫处理者。低氧联合NaCl胁迫下加入AG后，发芽3d的蚕豆中GABA含量减少了29.82％。低氧联合NaCl处理强烈抑制GAD活力，且抑制DAO活力的时间滞后。解除胁迫后蚕豆子叶中GAD与DAO活力显著提高。低氧条件下加入NaCl增强了胁迫强度，增加的GABA主要是多胺降解途径贡献的。解除胁迫后PAs积累。
　　4、研究了Ca2+对低氧联合NaCl胁迫下蚕豆发芽富集GABA的调节作用。6.0mmol/LCaCl2使发芽蚕豆子叶、胚芽及胚根中GABA含量分别提高了14.68％、19.30％和8.51％，EDTA显著降低GAD与DAO活力，导致GABA富集量的降低(P＜0.05)。Ca2+显著激活胚芽中GAD，对子叶和胚根则无显著影响(P＞0.05);在Ca2+处理基础上加入AG，使子叶和胚根中GAD活力增加，胚芽中GAD活力则下降，而各部位DAO活力下降，其中胚芽DAO活力被抑制(P＜0.05)。低氧联合NaCl胁迫下CaCl2处理后，胚根中Glu含量提高幅度最大，子叶次之，胚芽最小。EDTA处理显著降低子叶和胚芽中Glu含量，胚根中则显著升高(P＜0.05)。6.0mmol/L的CaCl2显著提高Put含量，EDTA加入后抑制了DAO活力，从而促进Put累积。
　　5、研究了低氧联合NaCl胁迫下ABA对发芽蚕豆富集GABA的调节作用。ABA处理促使GAD和DAO活力升高（P＜0.05），同时GABA和Glu的累积具有显著作用(P＜0.05)。在ABA处理基础上加入AG后，子叶和胚芽中Glu分别降低了35.15％和29.85％;ABA处理后，发芽蚕豆子叶、胚芽以及胚根中Put含量分别提高83.92％、125.79％和100.76％;在ABA处理基础上添加AG后，子叶和胚根中Put含量继续升高。ABA可显著提高Spd和Spm的累积量。氟草酮(Flu)处理显著降低子叶和胚芽GAD活力以及子叶DAO活力，胚芽和胚根中GABA含量分别降低21.07％和28.88％;在Flu处理基础上添加AG后，发芽蚕豆胚芽和胚根中DAO活力分别降低26.58％和11.26％，对发芽蚕豆中Glu含量无显著影响(P＞0.05);Flu导致Put和Spm累积，Spd含量则显著下降。
　　6、采用RACE(Rapid-amplificationofcDNAends)技术，设计兼并引物、3'和5'端特异性引物，克隆发芽蚕豆GAD和DAO基因。将中间片段、上游及下游cDNA序列拼接，分别得到1787bp和2199bp的GAD与DAO基因序列（包含部分内含子）。运用DNAStar和BioXM在线软件分析上述序列，发现GAD基因序列包含有1527bp开放阅读框，可编码509个氨基酸(GenBank登录号:JX444699);DAO基因包含有2025bp开放阅读框，可编码675个氨基酸（GenBank登录号:JX444698）。
　　7、研究了低氧联合NaCl胁迫处理下GABA富集与GAD和DAO基因表达的关系。低氧或低氧联合NaCl处理均显著提高发芽蚕豆GAD和DAO活力，促进GABA的富集。NaCl处理后发芽蚕豆子叶中GABA的富集效果最好。低氧和低氧联合NaCl胁迫处理均促进发芽蚕豆胚根中GAD基因的表达。在低氧胁迫下，发芽蚕豆各部位中DAO基因表达水平反而下调，低氧下AG处理和低氧联合NaCl胁迫处理对子叶和胚芽中GAD基因表达有显著促进作用;当采用低氧联合NaCl胁迫时，发芽蚕豆子叶和胚芽中DAO基因表达水平显著上调。
　　8、低氧联合NaCl胁迫下外源CaCl2显著提高了发芽蚕豆胚芽中GAD和DAO活力，子叶和胚芽中GABA含量显著提高(P＜0.05)。EDTA处理降低了发芽蚕豆各部位GAD和DAO活力，并显著降低子叶和胚根中GABA含量。CaCl2处理显著提高发芽蚕豆子叶中GAD基因表达量，却显著降低胚根中的表达量(P＜0.05)，对胚芽中的表达量无显著影响。与GAD不同，CaCl2处理显著提高发芽蚕豆胚芽中DAO基因的表达量，对子叶中的表达量无显著影响，却显著降低了胚根中的表达量。EDTA处理显著降低发芽蚕豆子叶中GAD基因表达量，而显著提高胚芽中其表达量，对胚根中无显著影响，但是促进了发芽蚕豆各部位中DAO基因的表达。
　　9、低氧联合NaCl胁迫下ABA处理使发芽蚕豆GAD和DAO活力显著升高，同时GABA含量显著增加;ABA处理显著降低发芽蚕豆子叶和胚根中GAD基因表达量，但使胚芽中其表达量提高。与GAD基因表达情形不同，ABA处理使发芽蚕豆各部位的DAO基因表达量上升。当采用ABA合成抑制剂Flu处理发芽蚕豆时，GAD和DAO活力被不同程度地抑制，同时GABA富集量显著降低，然而GAD基因被诱导表达。Flu提高了子叶和胚根中DAO基因表达量，却降低了胚芽中其表达量。当AG处理时，DAO活力被抑制的同时，GABA富集量也显著下降，继而诱导了GAD基因的表达。

目录

声明

摘要

表格索引

图形索引

缩略词表

第一章 文献综述

1 GABA代谢途径

1．1 GABA支路

1．2 多胺降解途径

2 植物中富集GABA的相关酶研究进展

2．1 谷氨酸脱羧酶(GAD)

2．2 二胺氧化酶(DAO)

2．3 GABA转氨酶(GABA-T)

2．4 琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)

3 高等植物富集GABA的方法及其影响因素

3．1 高等植物富集GABA的方法

3．2 影响高等植物GABA富集的因素

4 高等植物中GABA富集与信号传导和基因表达之间的关系

4．1 信号传导

4．2 GABA富集与基因表达

5 本研究目的意义和研究内容

5．1 本研究目的意义

5．2 主要研究内容

参考文献

第二章 发芽蚕豆GAD及DAO酶学性质研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要实验仪器设备

1．4 蚕豆发芽

1．5 实验设计

1．6 测定指标与方法

1．7 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 蚕豆发芽过程中GAD及DAO活力变化

2．2 发芽蚕豆中GAD和DAO的分离纯化和酶学特性研究

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 低氧及其胁迫下NaCl对发芽蚕豆GABA富集的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要实验仪器设备

1．4 蚕豆预处理

1．5 实验设计

1．6 测定指标与方法

1．7 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 低氧胁迫对发芽蚕豆GABA富集的影响

2．2 低氧胁迫下NaCl处理对发芽蚕豆GABA富集的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 低氧联合NaCl胁迫下Ca2+及ABA对发芽蚕豆GABA富集的调节作用

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 仪器设备

1．4 蚕豆预处理

1．5 实验设计

1．6 测定指标与方法

1．7 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 Ca2+对GABA富集的影响

2．2 ABA对发芽蚕豆GABA富集的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第五章 低氧及其联合NaCl胁迫下发芽蚕豆GABA富集的分子调节机制研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 仪器设备

1．4 发芽蚕豆GAD及DAO基因的cDNA全长克隆

1．5 蚕豆预处理

1．6 试验设计

1．7 测定指标与方法

1．8 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 发芽蚕豆GAD及DAO基因cDNA全长克隆及序列分析

2．2 低氧及其联合NaCl处理对关键酶基因表达和GABA富集的影响

2．3 Ca2+和EDTA处理对关键酶基因表达和GABA富集的影响

2．4 ABA和Flu处理对关键酶基因表达和GABA富集的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

创新说明

致谢

攻读学位期间发表的学术论文