组织蛋白酶L与苹果酸对牛背最长肌肌内结缔组织特性与剪切力的影响

摘要

在结构上影响肉剪切力值的主要成分为肌原纤维蛋白和结缔组织。目前，有关剪切力值的研究大多集中在肌原纤维的变化上，从结缔组织层面探讨牛肉剪切力值的研究较少。在动物生理成熟过程以及脂肪沉积过程中肌内结缔组织中成熟交联、蛋白多糖的变化是否会对结缔组织特性产生影响，进而影响牛肉剪切力值未见系统报道。组织蛋白酶对于肌纤维的降解存在争议，而其对结缔组织的弱化机制更是鲜有报道。有机酸可以弱化结缔组织，但作用机理未见系统报道。基于如上问题，本研究从胶原蛋白、成熟交联入手，探索了不同花纹等级和不同齿龄下结缔组织特性和剪切力值的关系;采用SDS-PAGE、Western-blot、扫描电镜、透射电镜、光镜、红外光谱、CD光谱、DSC技术，观察组织蛋白酶L和苹果酸处理对肌原纤维蛋白、结缔组织的弱化现象，具体研究内容如下。
　　1.牛背最长肌肌内结缔组织中成熟交联、蛋白多糖、糖胺聚糖与结缔组织特性和剪切力值关系
　　在齿龄相同情况下，随着牛背最长肌花纹等级的增加，肌内结缔组织中成熟交联含量、核心蛋白聚糖(decorin)和糖胺聚糖(GAGs)的含量逐渐降低，从而导致胶原蛋白性质发生变化，胶原蛋白的热溶解性升高，牛肉剪切力值降低。扫描电镜表明在肌内脂肪较多的牛背最长肌中胶原纤维分散成丝状，结构较松散。在花纹等级相同情况下，随着生理成熟度增加（0、1、2、3和4对永久门齿），肌内成熟交联含量、核心蛋白聚糖和糖胺聚糖的含量也随之增加，胶原蛋白热溶解性降低，剪切力值增大;胶原纤维排列紧密，呈片状或者簇状分布，结构紧密。多元统计结果表明，成熟交联含量、蛋白多糖和糖胺聚糖含量与结缔组织热溶解性显著负相关，与剪切力值显著正相关;牛肉剪切力值的大小首先取决于结缔组织中胶原蛋白的热溶解性、成熟交联、蛋白多糖和糖胺聚糖含量，其次取决于结缔组织中胶原蛋白的含量。
　　2.组织蛋白酶L降解肌原纤维蛋白和结缔组织的研究
　　通过酸化、硫酸铵沉降、透析、浓缩、DEAE-Sephacel、Sephacryl S-100、SP SepharoseFast Flow、Blue Sepharose Fast Flow和ConA Sepharose4B层析，纯化得到牛胰脏组织蛋白酶L，其分子量约为30 kDa，最适pH为5.5。SDS-PAGE显示，组织蛋白酶L可以水解肌球蛋白重链(MHC)、肌钙蛋白T、原肌球蛋白以及肌球蛋白轻链(MLC1);肌动蛋白、α-肌动素、肌间线蛋白、肌钙蛋白Ⅰ降解不明显。透射电镜研究发现，组织蛋白酶L主要破坏肌原纤维A带区域（主要是MHC），对于Z线及附近蛋白(肌动蛋白，骨架蛋白）降解能力较弱，这与钙激活酶的水解机制不同。圆二色谱研究表明，随着肌原纤维蛋白的水解，肌原纤维蛋白二级结构中α-螺旋结构的相对含量下降了13.2％,β-折叠含量增加了108.6％。
　　组织蛋白酶L可使肌内结缔组织的热变性温度显著降低。未处理组初始变性温度To为60.63℃，在pH5.0和pH5.5的柠檬酸缓冲溶液中，其To值分别降低至57.87℃和59.73℃。在pH5.0的酶处理组，经过36 h酶解处理后To值降低至41.41℃(P＜0.05)。而在pH5.5的酶处理组，To值降低了3.16℃(P＜0.05)。对于峰值变性温度Tp，在pH5.0和36h条件下，组织蛋白酶L使峰值变性温度Tp由65.38℃降低至43.79℃（P＜0.05）;而在pH5.5、36 h处理组中，Tp降低至60.79℃（P＞0.05）。这表明，pH越低，组织蛋白酶L对结缔组织降解作用越明显。SDS-PAGE表明组织蛋白酶L对胶原蛋白的水解位点不在α链的三螺旋区，而在端肽区。此外，组织蛋白酶L可以降解蛋白多糖，反应体系pH越低，组织蛋白酶水解效率越高。胶原蛋白端肽区和蛋白多糖的水解共同改变了结缔组织的性质，从而影响牛肉的剪切力值。
　　3.苹果酸影响牛肉肌内结缔组织性质及其嫩化牛肉研究
　　苹果酸可降低牛背最长肌剪切力值和肌内胶原蛋白的含量。苹果酸处理24 h后，肌内胶原蛋白含量由空白组中4.7 mg/g逐渐降低至3.5 mg/g，热溶解性由空白组的17％上升至24％。组织学观察表明，酸处理使得初级肌束膜和次级肌柬膜的厚度都有所减小，24 h后，初级肌束膜发生一定程度破坏。与此同时，结缔组织的初始变性温度和峰值变性温度（To和TP）均显著降低，分别由未处理组的60.63℃和65.38 C降低至37.55℃和40.15℃(P＜0.05)。苹果酸使结缔组织中的蛋白多糖逐步解离。衰减全反射-傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)结果表明，酸处理后胶原蛋白二级结构变化不明显，仅310-螺旋、反向聚集片与β-转角结构发生较小转化;这可能与核心蛋白聚糖的解离有关。胶原蛋白“热稳定区”的构象发生局部转变，使得胶原蛋白三螺旋链更易发生解旋，胶原蛋白更容易发生热变性。

目录

声明

摘要

缩写符号

前言

第一章 文献综述

1 肌肉组成和嫩度

1．1 结缔组织

1．2 肌原纤维蛋白

2 牛肉嫩化

2．1 宰后嫩度改善和相关蛋白酶系统

2．2 嫩化方法

3 蛋白质的二级结构和蛋白功能

3．1 圆二色谱及其在蛋白质二级结构表征中的应用

3．2 红外光谱及其在蛋白质二级结构表征中的应用

4 研究目的及研究内容

参考文献

第二章 肌内结缔组织特性与牛背最长肌剪切力关系研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 仪器和试剂

1．3 方法

2 结果与分析

2．1 成熟交联对结缔组织特性和剪切力值影响

2．2 蛋白多糖对结缔组织特性和剪切力值影响

2．3 成熟交联、蛋白多糖、结缔组织特性和剪切力值内在关系多元统计分析

2．4 肌束膜扫描电镜观察

3 讨论

3．1 不同花纹等级牛背最长肌肌内结缔组织特性与剪切力内在关系

3．2 不同齿龄牛背最长肌肌内结缔组织特性与剪切力内在关系

4 小结

参考文献

第三章 组织蛋白酶L纯化及其降解肌原纤维蛋白研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试剂和仪器

1．3 方法

2 结果与分析

2．1 组织蛋白酶L纯化

2．2 组织蛋白酶L对肌原纤维蛋白水解研究

2．3 组织蛋白酶L对肌肉超微结构影响

2．4 组织蛋白酶L水解肌原纤维蛋白及其二级结构转变

3 讨论

3．1 组织蛋白酶L纯化结果

3．2 组织蛋白酶L降解肌原纤维蛋白

3．3 组织蛋白酶L弱化肌肉结构

3．4 组织蛋白酶L降解肌原纤维蛋白及其二级结构变化

4 小结

参考文献

第四章 组织蛋白酶L对牛肉肌内结缔组织降解研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试剂和仪器

1．3 方法

2 结果与分析

2．1 组织蛋白酶L对肌内结缔组织热转变温度影响

2．2 组织蛋白酶L对肌内结缔组织胶原蛋白降解作用

2．3 组织蛋白酶L对肌内结缔组织中核心蛋白聚糖的降解作用

2．4 牛胰组织蛋白酶L对肌内结缔组织超微结构的影响

3 讨论

3．1 组织蛋白酶L降解胶原蛋白

3．2 组织蛋白酶L降解核心蛋白聚糖

3．3 组织蛋白酶L处理降低结缔组织热转变温度

3．4 组织蛋白酶L处理弱化肌束膜结构

4 小结

参考文献

第五章 苹果酸对肌内结缔组织弱化研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试剂和仪器

1．3 方法

2 结果与分析

2．1 苹果酸对剪切力值的影响

2．2 苹果酸对肌内结缔组织胶原蛋白总量及热溶解性的影响

2．3 苹果酸对肌束膜厚度及牛肉微观结构的影响

2．4 苹果酸对肌内结缔组织热变性温度的影响

2．5 苹果酸对肌内结缔组织中核心蛋白聚糖的解离作用

2．6 苹果酸对肌内结缔组织中胶原蛋白二级结构的影响

3 讨论

3．1 苹果酸处理改变胶原蛋白特性

3．2 苹果酸处理降低肌束膜厚度

3．3 苹果酸处理降低结缔组织热转变温度

3．4 苹果酸处理影响胶原蛋白二级结构

3．5 苹果酸处理降低剪切力

4 小结

参考文献

全文结论

创新说明

致谢

攻读博士学位期间发表的论文