黄河鲤鱼鳞胶原蛋白的性质及胶原肽活性研究

摘要

我国是淡水鱼养殖大国，黄河鲤鱼是淡水鱼中常见的一种。鱼鳞中胶原蛋白含量较为丰富，然而，鱼鳞多作为废弃物处理，不仅浪费资源，而且对环境造成污染。以鱼鳞为原料提取胶原蛋白和明胶，以及进一步生产具有生理功能的生物活性肽，既能减轻环境污染，又充分利用了鱼鳞资源，达到了淡水鱼的综合利用目的，同时还提高了鱼类产品的附加值。
　　本研究以黄河鲤鱼鳞为原料，对鱼鳞的预处理、胶原蛋白的提取技术、胶原蛋白的化学结构和理化性质、明胶的制备工艺和功能性质进行了研究，建立了黄河鲤鱼鳞胶原蛋白和明胶的提取技术。对鱼鳞明胶消化产物的抗氧化活性、酪氨酸酶抑制能力以及对小鼠B16黑素瘤细胞黑色素合成的影响进行了研究。
　　首先对黄河鲤鱼鳞的预处理工艺进行了研究。考察了不同工艺参数对鱼鳞矿物质脱除的影响。结果表明稀HCl溶液能够有效脱除鱼鳞中矿物质成分，得出最优工艺条件为:浸泡时间95min、HCl溶液浓度1.0M和料液比11mL/g。考察了碱液处理条件对鱼鳞杂蛋白脱除的影响。得出最优工艺条件为:浸泡时间26h、NaOH溶液浓度0.17M和料液比11mL/g。对鱼鳞预处理流程进行了比较研究。研究的结果表明:先脱除矿物质成分后更有利于鱼鳞中杂蛋白成分的去除。
　　研究了黄河鲤鱼鳞胶原蛋白的理化性质和结构。对鱼鳞胶原蛋白进行了电泳分析，研究结果显示鱼鳞胶原蛋白属于Ⅰ型胶原，分子构成可能为(α1)2α2型或α1α2α3型。红外光谱分析表明PSC与ASC的主体构型没有差异，胃蛋白酶不会造成胶原蛋白三螺旋结构的破坏。黄河鲤鱼鳞ASC和PSC的热变性温度分别为31.4℃和31.8℃，其热收缩温度分别为52.9℃和55.3℃。溶解性实验表明黄河鲤鱼鳞ASC和PSC的等电点都在pH7左右。
　　研究了黄河鲤鱼鳞明胶的提取工艺。工艺参数包括:提取温度、超声时间、超声功率和料液比，结果表明黄河鲤鱼鳞明胶的超声辅助热水提取最佳工艺参数为:提取温度70℃、超声处理时间100min、超声功率300W、料液比10mL/g。在此条件下制取的鱼鳞明胶粘度为4.8mPa·s，凝冻强度为186Bloomg，等离子点为pH6.2。
　　对黄河鲤鱼鳞明胶的模拟消化进行了研究。在37℃温度条件下，先采用胃蛋白酶对鱼鳞明胶进行2h酶解处理，随后采用胰蛋白酶消化2h研究鱼鳞明胶在胃肠道的消化特性。对鱼鳞明胶模拟消化的研究表明:胃蛋白酶对鱼鳞明胶的消化能力较弱，对胶原α-链和β-链不具有水解作用，而胰蛋白酶对鱼鳞明胶肽链有较强的酶解作用，鱼鳞明胶经消化后水解度可到达16.9％。对鱼鳞明胶消化产物的抗氧化活性和酪氨酸酶酶活性进行了研究，结果表明:消化产物的抗氧化性能和酪氨酸酶抑制活力与其消化过程中水解度有较强的相关性。
　　应用超滤技术将黄河鲤鱼鳞明胶消化产物按相对分子质量的不同分为3个组分:JCP1(Mw＞3000Da)、JCP2(1000Da＜Mw＜3000Da)和JCP3(Mw＜1000Da)。研究了不同相对分子质量组分的抗氧化性能，实验结果表明，JCP3组分具有最强的羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力以及最强的还原力和金属离子螯合能力，JCP3组分清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为0.57mg/mL和1.01mg/mL;JCP2组分具有较强的DPPH自由基清除能力，而JCP2和JCP3组分对脂质氧化的抑制能力相当。
　　研究了黄河鲤鱼鳞明胶消化产物中不同相对分子质量组分的酪氨酸酶抑制活性，研究结果表明，JCP3组分对酪氨酸酶单酚酶稳定态活力的抑制作用最强，其IC50值为75.24μg/mL。不同相对分子质量的鱼鳞明胶肽均能对酪氨酸酶的二酚酶活性产生抑制作用，且具有明显的量效关系，其中JCP3组分具有最强的酪氨酸酶二酚酶活性抑制作用，其IC50值为51.11μg/mL。
　　研究了黄河鲤鱼鳞明胶消化产物对小鼠B16黑素瘤细胞的药效学效果，实验结果表明:黄河鲤鱼鳞明胶模拟消化产物能够促进小鼠B16黑素瘤细胞的增殖，对小鼠B16黑素瘤细胞无细胞毒性。研究了鱼鳞明胶消化产物中JCP3组分对小鼠B16黑素瘤细胞黑色素生物合成的影响，研究结果表明:JCP3组分能够减少小鼠B16黑素瘤细胞中黑色素的产生量，能够降低小鼠B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶的活力，能够增加小鼠B16黑素瘤细胞中GSH的含量和降低其GSSG的含量，能够降低小鼠B16黑素瘤细胞中cAPM的含量。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 鱼鳞胶原蛋白的研究

1．1．1 胶原蛋白的概述

1．1．2 鱼鳞胶原蛋白的提取

1．1．3 鱼鳞胶原蛋白的类型及结构

1．1．4 鱼鳞胶原蛋白的性质

1．2 鱼鳞明胶的研究

1．2．1 明胶的概述

1．2．2 鱼鳞明胶的制备

1．2．3 鱼鳞明胶的结构和理化性质

1．2．4 鱼鳞明胶的应用

1．3 生物活性肽的研究

1．3．1 生物活性肽的制备

1．3．2 生物活性肽的的功能

1．3．3 食源性生物活-眭肽的应用

1．3．4 食源性生物活性肽的问题

1．4 黑色素及酪氨酸抑制剂的研究

1．4．1 黑色素的形成机制

1．4．2 黑色素的抑制机制

1．5 本论文的立题依据、意义及主要研究内容

1．5．1 立题依据和研究意义

1．5．2 主要研究内容

参考文献

第二章 黄河鲤鱼鳞胶原蛋白提取及理化性质

2．1 前言

2．2 实验材料与仪器设备

2．2．1 实验材料与试剂

2．2．2 实验仪器及设备

2．3 实验方法

2．3．1 黄河鲤鱼鳞基本成分的测定

2．3．2 羟脯氨酸的测定

2．3．3 鱼鳞的矿物质脱除

2．3．4 鱼鳞的杂蛋白脱除

2．3．5 鱼鳞胶原蛋白的提取

2．3．6 氨基酸组成分析

2．3．7 SDS-PAGE电泳分析

2．3．8 紫外扫描分析

2．3．9 红外光谱分析

2．3．10 热变性温度的测定

2．3．11 微量差示扫描量热分析

2．3．11 鱼鳞胶原蛋白的溶解性测定

2．3．12 实验数据的统计分析

2．4 实验结果与分析

2．4．1 黄河鲤鱼鳞的基本成分

2．4．2 黄河鲤鱼鳞的胶原蛋白含量

2．4．3 黄河鲤鱼鳞矿物质脱除工艺的确定

2．4．4 黄河鲤鱼鳞杂蛋白脱除工艺的确定

2．4．5 鱼鳞胶原蛋白的氨基酸组成

2．4．6 鱼鳞胶原蛋白的SDS-PAGE电泳结果

2．4．7 鱼鳞胶原蛋白的结构

2．4．8 鱼鳞胶原蛋白的热性质

2．4．9 鱼鳞胶原蛋白的溶解性

2．5 本章小结

参考文献

第三章 黄河鲤鱼鳞明胶的制备及功能性质

3．1 前言

3．2 实验材料与仪器设备

3．2．1 实验材料与试剂

3．2．2 实验仪器及设备

3．3 实验方法

3．3．1 黄河鲤鱼鳞明胶的提取

3．3．2 鱼鳞明胶粘度的测定

3．3．3 鱼鳞明胶凝冻强度的测定

3．3．4 鱼鳞明胶胶等离子点的测定

3．3．5 鱼鳞明胶起泡性和泡沫稳定性的测定

3．3．6 鱼鳞明胶乳化-陛和乳化稳定性的测定

3．4 实验结果与分析

3．4．1 黄河鲤鱼鳞明胶提取工艺确定

3．4．2 鱼鳞明胶的粘度和凝冻强度

3．4．3 黄河鲤鱼鳞明胶的等离子点

3．4．4 鱼鳞明胶的起泡性及泡沫稳定性

3．4．5 鱼鳞明胶的乳化性及乳化稳定性

3．5 本章小结

参考文献

第四章 鱼鳞明胶消化产物的抗氧化活性

4．1 前言

4．2 实验材料与仪器设备

4．2．1 实验材料与试剂

4．2．2 实验仪器及设备

4．3 实验方法

4．3．1 鱼鳞明胶的模拟消化

4．3．2 水解度的测定

4．3．3 模拟消化液不同相对分子质量组分的制备

4．3．4 羟基自由基清除能力的测定

4．3．5 超氧阴离子自由基清除能力的测定

4．3．6 DPPH·自由基清除能力的测定

4．3．7 还原力的测定

4．3．8 脂质氧化抑制能力的测定

4．3．9 金属离子螯合能力的测定

4．3．5 实验数据的统计分析

4．4 结果与分析

4．4．1 鱼鳞明胶模拟消化过程中水解度的变化

4．4．2 羟基自由基的清除能力

4．4．3 超氧阴离子自由基的清除能力

4．4．4 DPPH·自由基的清除能力

4．4．5 还原力

4．4．6 脂质氧化抑制能力

4．4．7 金属离子螯合能力

4．5 本章小结

参考文献

第五章 鱼鳞明胶消化产物的酪氨酸酶抑制活性

5．1 前言

5．2 实验材料与仪器设备

5．2．1 实验材料与试剂

5．2．2 实验仪器及设备

5．3 实验方法

5．3．1 酪氨酸酶活性抑制实验

5．3．2 鱼鳞明胶消化产物对酪氨酸酶单酚酶活力的影响

5．3．3 鱼鳞明胶消化产物对酪氨酸酶二酚酶活力的影响

5．3．4 鱼鳞明胶消化产物对酪氨酸酶二酚酶的抑制机理

5．3．5 实验数据的统计分析

5．4 实验结果与分析

5．4．1 鱼鳞明胶消化过程中酪氨酸酶抑制能力的变化

5．4．2 鱼鳞明胶消化产物对酪氨酸酶单酚酶活力的影响

5．4．3 鱼鳞明胶消化产物对酪氨酸酶二酚酶活力的影响

5．4．4 鱼鳞明胶肽对酪氨酸酶的抑制机理

5．5 本章小结

参考文献

第六章 鱼鳞明胶消化产物对B16黑素瘤细胞黑色素合成的影响

6．1 前言

6．2 实验材料与仪器设备

6．2．1 实验材料与试剂

6．2．2 实验仪器及设备

6．3 实验方法

6．3．1 细胞增殖活性的测定

6．3．2 黑素含量的测定

6．3．3 酪氨酸酶活性的检测

6．3．4 GSH和GSSG的检测

6．3．4 cAMP的检测

6．3．4 实验数据的统计分析

6．4 实验结果与分析

6．4．1 鱼鳞明胶消化产物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖的影响

6．4．2 鱼鳞明胶消化产物对小鼠B16黑素瘤细胞黑素含量的影响

6．4．3 鱼鳞胶原肽对小鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响

6．4．4 鱼鳞胶原肽对小鼠B16黑素瘤细胞GSH含量的影响

6．4．5 鱼鳞胶原肽对小鼠B16黑素瘤细胞GSSG含量的影响

6．4．5 鱼鳞胶原肽对小鼠B16黑素瘤细胞cAMP含量的影响

6．5 讨论

6．6 本章小结

参考文献

第七章 结论与展望

7．1 主要结论

7．2 主要创新点

7．3 展望

致谢

攻读博士学位期间的科研成果