扫频超声预处理对玉米醇溶蛋白特性及其酶法制备ACE抑制肽的影响

摘要

玉米醇溶蛋白为玉米淀粉加工工业的主要副产物，因其含有大量的非极性氨基酸，不溶于水，此外还缺乏色氨酸和赖氨酸，营养价值低，在食品工业中的应用受到限制。国内外研究表明，玉米醇溶蛋白酶解物具有良好的ACE抑制活性，但是传统的制备方法存在酶解时间长、酶的使用效率低和产物转化率低等缺点。本论文旨在通过扫频超声波预处理改善玉米醇溶蛋白酶解制备ACE抑制肽的效率和产品活性。基此，本文初步研究了扫频超声场的性质;系统研究了扫频超声处理后，玉米醇溶蛋白溶解度、巯基含量、表面疏水性等理化性质，荧光光谱、红外光谱、圆二色谱等分子结构特征，以及表面形貌、粒径等蛋白颗粒表面微观结构的变化;探讨了经超声处理后玉米醇溶蛋白制备ACE抑制肽的酶解特性;研究了超声预处理后反应热动力学特性的变化。主要研究结论如下:
　　(1)关于扫频超声场的声学性质，高速摄像法和碘释放法的研究表明，40kHz的超声振板产生的超声空化产额最高，观察到的超声空化现象最为明显，且扫频模式的效果优于定频模式。
　　(2)关于扫频超声对玉米醇溶蛋白理化性质影响的研究发现，一定的扫频超声处理能够显著提高玉米醇溶蛋白的水溶性和疏水性、促使肽链伸展、改变其转变温度，上述参数的变化说明超声可以被用于促使蛋白向着有利于酶解反应的方向发展，尤其是疏水性的增加，意味着超声波引起了蛋白内部疏水性氨基酸外露，更有利于蛋白内部疏水性基团与酶的接触，从而可制备出高活性的ACE抑制肽。
　　(3)关于扫频超声对玉米醇溶蛋白分子结构特性的影响，紫外和荧光发射光谱分析发现，超声波改变了蛋白的结构，处理后表现出荧光猝灭现象，说明超声波使玉米醇溶蛋白多肽链发生了不同程度的伸展;红外光谱和圆二色谱分析表明，超声波处理后玉米醇溶蛋白α-螺旋结构的含量逐渐增加，β-折叠和无规则卷曲变化无规律，表明扫频超声处理改变了包括氢键在内的维持玉米醇溶蛋白二级结构的作用力，从而使四种二级结构的含量发生了变化。
　　(4)关于扫频超声对玉米醇溶蛋白颗粒微观结构的影响，原子力显微镜测试结果表明，超声波使得玉米醇溶蛋白良好的网状结构被破坏断裂，导致很多蛋白聚集体变得分散，并出现了许多游离球状蛋白颗粒;玉米醇溶蛋白颗粒变小，且蛋白更加均匀;电子显微镜分析表明，与对照相比，超声波使玉米醇溶蛋白颗粒表面更加粗糙，甚至出现小的空洞，表明超声导致蛋白颗粒疏松，蛋白酶容易进入玉米醇溶蛋白颗粒内部，有利于疏水性氨基酸的释放;粒径检测发现，较高频率的超声使蛋白分子粒径分布向大的粒径方向迁移，表明扫频超声预处理引起了玉米醇溶蛋白分子的极化;破坏了维持蛋白分子四级结构的作用力，导致了蛋白亚基解离和疏水性基团的外露;两极分化的亚基相互吸引通过非共价键重新形成更大的蛋白聚集体。
　　(5)关于扫频超声对玉米醇溶蛋白酶解特性影响的研究发现，定频和扫频两种模式的超声波均能引起玉米醇溶蛋白水解度的显著提高，且能不同程度地改变玉米醇溶蛋白酶解液的ACE抑制率;其中40±2kHz扫频超声波预处理玉米醇溶蛋白时，其水解度最高提高了21.7％，而其酶解液的ACE抑制率最高达到了46.1％，比对照组抑制率提高1.33倍;40±2kHz/68±2kHz组合双频组合超声波预处理后，酶解液的抑制活性最高为43.7％，与未超声对照组相比提高了1.21倍。酶解产物分子量分布及氨基酸分析进一步表明，超声波预处理后酶解产物的小分子量肽链增多，疏水性氨基酸含量和支链氨基酸含量提高，这些都与酶解产物ACE抑制率的提高有关。
　　(6)关于扫频超声对玉米醇溶蛋白酶解热动力学参数的影响。单频扫频超声波和双频扫频式超声波分别使玉米醇溶蛋白的Ea从5.84kJ/mol降到4.70和5.74kJ/mol;使ΔH从46.05kJ/mol降到36.55和45.20kJ/mol。说明扫频超声预处理均有利于蛋白酶解催化反应的进行，使反应更容易。

目录

声明

摘要

缩写表

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 玉米醇溶蛋白的分类与组成

1．2．1 玉米醇溶蛋白的命名与分类

1．2．2 玉米醇溶蛋白的组成

1．2．3 玉米醇溶蛋白的结构

1．3 玉米醇溶蛋白的应用研究现状

1．4 玉米醇溶蛋白功能活性肽的研究进展

1．4．1 玉米醇溶蛋白功能活性肽的生理活性研究

1．4．2 玉米醇溶蛋白功能活性肽的制备方法研究现状

1．4．3 酶法制备玉米醇溶蛋白功能活性肽存在的主要问题

1．5 超声波预处理蛋白制备功能活性肽的应用研究

1．5．1 超声波简介及其应用

1．5．2 超声波处理在酶解反应中的应用

1．5．3 影响超声波处理在酶解反应中的因素

1．6 本课题的立题背景、意义及主要研究内容

1．6．1 立题背景和研究意义

1．6．2 主要研究内容

第二章 扫频超声场性质的研究

2．1 前言

2．2 试验材料与仪器设备

2．3 研究方法

2．3．1 高速摄像法

2．3．2 碘释放法

2．4 试验结果与分析

2．4．1 超声频率为22、28和33kHz超声振板的空化泡形态

2．4．2 超声频率为40 kHz超声振板的空化泡形态

2．4．3 超声频率为68kHz超声振板的空化泡形态

2．4．4 扫频超声场的化学产额的研究

2．5 本章小结

第三章 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白理化性质及功能特征的影响

3．1 前言

3．2 试验材料与仪器设备

3．2．1 试验材料及试剂

3．2．2 试验仪器及设备

3．3 研究方法

3．3．1 玉米醇溶蛋白的扫频超声波预处理

3．3．2 玉米醇溶蛋白的溶解度测定

3．3．3 玉米醇溶蛋白差示量热扫描仪(DSC)的测定

3．3．4 玉米醇溶蛋白表面疏水性测定

3．3．5 玉米醇溶蛋白自由巯基含量的测定

3．4 试验结果与分析

3．4．1 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白溶解度的影响

3．4．2 扫频超声波预处理后玉米醇溶蛋白(DSC)分析

3．4．3 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白表面疏水性的影响

3．4．4 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白自由巯基含量影响

3．5 本章小结

第四章 扫频超声预处理对玉米醇溶蛋白结构特性的影响

4．1 前言

4．2 试验材料与仪器设备

4．2．1 试验材料及试剂

4．2．2 试验仪器及设备

4．3 研究方法

4．3．1 玉米醇溶蛋白的扫频超声波预处理

4．3．2 玉米醇溶蛋白紫外光谱扫描

4．3．3 玉米醇溶蛋白荧光光谱扫描

4．3．4 玉米醇溶蛋白圆二色谱的测定

4．3．5 玉米醇溶蛋白红外光谱的测定

4．3．6 玉米醇溶蛋白的粒径测定

4．3．7 原子力显微镜(AFM)观察

4．4 试验结果与分析

4．4．1 扫频超声波预处理后玉米醇溶蛋白紫外光谱分析

4．4．2 扫频超声波预处理后玉米醇溶蛋白内源性荧光光谱分析

4．4．3 扫频超声波预处理后玉米醇溶蛋白的圆二色谱分析

4．4．4 扫频超声波预处理后玉米醇溶蛋白的红外光谱分析

4．4．5 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白粒径分布的影响

4．4．6 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白聚集状态的影响

4．5 扫频超声预处理对玉米醇溶蛋白功能特性的影响机理分析

4．6 本章小结

第五章 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白酶解特性的影响

5．1 前言

5．2 试验材料与仪器设备

5．2．1 试验材料及试剂

5．2．2 试验仪器及设备

5．3 研究方法

5．3．1 玉米醇溶蛋白的扫频超声波预处理

5．3．2 玉米醇溶蛋白的酶解

5．3．3 水解度测定

5．3．4 ACE抑制率测定

5．3．5 扫描电镜(SEM)观察

5．3．6 氨基酸组成分析

5．3．7 分子量分布的测定

5．4 试验结果与分析

5．4．1 扫频超声预处理对玉米醇溶蛋白水解度(DH)的影响

5．4．2 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白酶解液ACE抑制率的影响

5．4．3 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白及酶解残渣微结构的影响

5．4．4 扫频超声预处理对玉米醇溶蛋白酶解产物分子量分布的影响

5．4．5 扫频超声波预处理对玉米醇溶蛋白酶解产物的氨基酸组成影响

5．5 本章小结

第六章 扫频超声预处理对玉米醇溶蛋白酶解热力学影响

6．1 前言

6．2 试验材料与仪器设备

6．2．1 试验材料及试剂

6．2．2 试验仪器及设备

6．3 试验方法

6．3．1 玉米醇溶蛋白的扫频超声波预处理

6．3．2 超声波处理参数的设定

6．3．3 玉米醇溶蛋白的酶解方法

6．3．4 反应热动力学研究

6．4 试验结果与分析

6．4．1 扫频超声预处理对玉米醇溶蛋白酶解反应速率常数的影响

6．4．2 扫频超声预处理对玉米醇溶蛋白酶解反应表观活化能、活化焓、活化熵和活化吉布斯自由能的影响

6．5 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 主要结论

7．2 创新点

7．3 展望

致谢

攻读博士学位期间取得的研究成果

参考文献