干酪乳杆菌LC2W胞外多糖制备、功能及结构的研究

摘要

近年来，乳酸菌胞外多糖已成为研究的热点，它不仅具有改善发酵食品流变、口感、和质构的重要作用，而且具有促进人体健康的重要生理活性，如抗诱变、抗肿瘤、免疫调节、降胆固醇等活性。本文对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的产生条件、分离纯化、生理功能、物化性质以及结构特征等进行了系统研究。 比较了不同乳酸菌培养基对干酪乳杆菌LC2W产生胞外多糖的影响，选择胞外多糖产量较高(83 mg/L)的脱脂奶粉为基础培养基。研究了以脱脂奶粉为基础培养基，添加不同碳源、氮源和其他盐类对胞外多糖产量的影响，其中大豆蛋白胨、葡萄糖和K<,2>HPO<,4>能显著提高胞外多糖产量，通过正交实验确定干酪乳杆菌LC2w优化培养基组成为：脱脂奶粉12.0％，大豆蛋白胨1.0％，葡萄糖1.5％，K<,2>HPO<,4> 0.1％。 采用单因素分析接菌量、培养温度和培养时间对干酪乳杆菌LC2W产生胞外多糖的影响，并通过响应面分析法确定高产胞外多糖工艺优化参数：接种量4.0％，培养温度32.5℃，培养时间26 hr。最适培养基和最优培养条件(不控制培养基pH)下EPS产量约为137 mg/L。研究发现控制pH 6.0发酵，EPS的产量最大为160 mg/L，较未控制pH时的产量提高了约17％。 发酵液通过加热灭酶后冷却离心除去凝结蛋白和菌体，然后用终浓度4.0％(w/v)的三氯乙酸除上清液中蛋白质，超滤浓缩后，用终浓度75％(v/v)乙醇沉淀得粗多糖LCP，得率为153.4 mg/L。 粗多糖LCP经过DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析分级纯化得到三个组分，由pH7.6 Tris-HC1缓冲液洗脱得到组分LCPl和LCP2，由0.2～1.0 mol/L NaCl的Tris-HC1缓冲液线性梯度洗脱得到组分LCP3，LCP1、LCP2和LCP3分别占LCP质量的35.74％，12.61％和33.34％，总回收率为81.7％。LCP1、LCP2和LCP3在Sepharose CL-6B和HPLC上都显示均一组分，结合紫外、红外图谱和其化学组成分析确定LCP1和LCP2是两种中性多糖，LCP3为一种蛋白质-多糖复合物，其中蛋白质含量约为60％。 胞外多糖LCP1、LCP2和LCP3分别以15 mg/kg体重剂量灌胃自发性高血压大鼠(SHR)，每天一次，连续灌胃7天，对照组灌胃生理盐水。结果显示LCP1能显著降低SHR的动脉收缩压(P<0.01)，最大降压幅度(约20 mmHg)出现在给药后2～4 h，LCP2和LCP3降血压效果不明显。LCP1、LCP2和LCP3对SHR心率均没有影响，说明这三组分对SHR的循环系统未产生不利影响。 胞外多糖LCP1对SHR降高血压的机理研究发现SHR连续灌胃胞外多糖LCP1可显著降低主动脉ACE活性，而对肺、肾及血清中ACE活力没有明显影响，对照组和LCP1组SHR血清中ET-1和CO含量没有明显不同。 体外淋巴细胞培养实验显示，LCP1、LCP2和LCP3均无细胞毒性，体外免疫活性实验可知，胞外多糖LCP1、LCP2和LCP3能显著抑制T/B淋巴细胞的增殖反应和混合淋巴的增殖反应，显示较强的免疫抑制活性。 利用毛细管电泳进一步鉴定LCP1的纯度，通过旋光仪测定LCP1水溶液中的比旋光度[α]<'25><,589>=62.0°(H<,2>O浓度1.12)，采用乌氏粘度计测得LCPl水溶液固有粘度[η]为1.930dL/g。示差折光检测仪测得LCP1在0.1 mol/L的NaNO<,3>溶液中比折光指数增量(dn/dc)为1.20。通过高效凝胶色谱测定LCP1重均分子量Mw为1.236×10<'6>Da、固有粘度[η]为1.875dL/g、多分散性指数Pd为1.202和Mark-Houwink指数为0.654，Mark-Houwink指数表明LCP1在0.1 mol/L的NaNO<,3>溶液中呈无规卷曲构象。 通过动态激光光散射研究表明LCP1分子在水溶液中聚集比较严重，达到45％，而在NaNO<,3>溶液中几乎不发生聚集，故确定0.1 mol/L NaNO<,3>溶液为研究LCP1溶液分子信息的理想溶剂。采用静态激光光散射测得LCP1在0.1 mol/L的NaNO<,3>溶液中的重均分子量Mw为1.276×10<'6>Da、回旋半径Rg为52.9 nm、第二维里系数A<,2>为2.44×10<'-4>cm<'3> mol/g<'2>；动态激光光散射测定LCP1水力半径R<,h>为34.8 nn3，p值(R<,g>/R<,h>)为1.61表明LCP1分子在溶液中呈无规卷曲的构象。 通过对LCP1溶液流变性质研究发现，高浓度LCP1溶液呈剪切变稀，低浓度时，剪切速率对粘度没有影响，溶液粘度随温度升高下降明显，pH对LCP1溶液粘度影响很小，盐可以降低LCP1溶液粘度，粘度降低与盐浓度有关，通过粘弹性研究发现LCP1溶液不能形成胶体。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1多糖简介

1.2乳酸菌胞外多糖的研究现状

1.2.1乳酸菌

1.2.2乳酸菌胞外多糖

1.3立题的背景和意义

1.4本课题主要研究内容

参考文献

第二章干酪乳杆菌LC2W胞外多糖发酵条件的优化

2.1前言

2.2材料与设备

2.2.1菌种

2.2.2试剂

2.2.3培养基

2.2.4主要仪器

2.3实验方法

2.3.1生长曲线的测定

2.3.2多糖含量的测定

2.3.3发酵液EPS含量的测定方法

2.3.4不同培养基对EPS产量的影响

2.3.5添加不同营养成分对LC2W EPS产量的影响

2.3.6培养条件对LC2W EPS产量的影响

2.4结果与讨论

2.4.1生长曲线

2.4.2基本培养基的选择

2.4.3添加不同营养成分对LC2W EPS产量的影响

2.4.4培养条件对LC2W EPS产量的影响

2.5本章小结

参考文献

第三章干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的分离纯化研究

3.1前言

3.2材料与设备

3.2.1试剂

3.2.2主要仪器

3.3实验方法

3.3.1 EPS提取纯化工艺流程

3.3.2蛋白质含量测定

3.3.3多糖含量测定

3.3.4粗多糖得率和提取率的计算

3.3.5脱蛋白方法

3.3.6超滤浓缩

3.3.7乙醇沉淀多糖

3.3.8 DEAE SepharoseFF离子交换柱分级纯化

3.3.9 Sepharose CL-6B柱层析纯化

3.3.10多糖纯度鉴定和分子量分布测定

3.3.11紫外光谱(UV)分析

3.3.12红外光谱(FI-IR)分析

3.3.13常规化学组成分析

3.4结果与讨论

3.4.1不同方法除蛋白效果的比较

3.4.2超滤浓缩

3.4.3乙醇沉淀多糖

3.4.4 DEAE SepharoseFF离子交换柱纯化

3.4.5 Sepharose CL-6B柱层析

3.4.6多糖的纯度鉴定和相对分子量分布测定

3.4.7紫外光谱分析

3.4.8红外光谱(IR)分析

3.4.9化学组成分析

3.5本章小结

参考文献

第四章干酪乳杆菌LC2W胞外多糖生物活性的研究

4.1前言

4.2材料与设备

4.2.1实验动物

4.2.2主要试剂

4.2.3主要仪器

4.3实验方法

4.3.1降高血压研究

4.3.2体外免疫活性研究

4.4结果与讨论

4.4.1高血压活性的研究

4.4.2体外免疫活性研究

4.5本章小结

参考文献

第五章胞外多糖LCP1物化性质的研究

5.1前言

5.2材料与设备

5.2.1主要试剂

5.2.2主要仪器

5.3实验方法

5.3.1 LCP1毛细管电泳法纯度鉴定

5.3.2 LCP1旋光度测定

5.3.3 LCP1固有粘度测定

5.3.4 LCP1高效体积排阻色谱(HPSEC)分析

5.3.5 LCP1光散射研究

5.3.6 LCP1流变性质研究

5.3.7离子色谱法测定单糖组成

5.4结果与讨论

5.4.1 LCP1毛细管电泳

5.4.2 LCP1旋光性分析

5.4.3 LCP1固有粘度

5.4.4 LCP1高效体积排阻色谱分析

5.4.5 LCP1光散射研究

5.4.6 LCP1的流变性质

5.4.7 LCP1单糖组成

5.5本章小结

参考文献

第六章胞外多糖LCP1的结构分析

6.1前言

6.2材料与设备

6.2.1主要试剂

6.2.2主要仪器

6.3实验方法

6.3.1元素分析

6.3.2脱O-乙酰基

6.3.3高碘酸氧化

6.3.4 Smith降解

6.3.5甲基化分析

6.3.6核磁共振分析

6.3.7部分酸水解

6.4结果与讨论

6.4.1LCP1元素分析

6.4.2脱O-乙酰基

6.4.3高碘酸氧化

6.4.4 Smith降解

6.4.5部分酸水解

6.4.6甲基化分析

6.4.7 NMR分析

6.4.8 LCP1一级结构表征

6.5本章小结

参考文献

主要结论与展望

论文创新点

发表论文清单

致谢