一种新的Bifidobacterium infantis细菌素的分离，鉴定和性质分析

摘要

双歧杆菌在母乳喂养儿肠道内大量存在，对婴幼儿有很多好处，如营养、免疫及抗感染作用等。多年的临床研究表明，人在摄入一定量的双歧杆菌除了能提供基本的营养作用之外，还有抗过敏、抗肿瘤、调整肠道功能等多种促进人体健康的作用，作为一种益生菌，双歧杆菌在食品和医药领域有着越来越多的应用。但在双歧杆菌对致病菌的抑制作用研究方面，人们一直认为双歧杆菌之所以能够抗菌是因为它们能产生有机酸，如乳酸和乙酸等，而最新的研究表明某些双歧杆菌中基因编码的抗菌肽(细菌素或类细菌素类物质)也是它们有抑菌活性的重要原因之一。
　　 本论文选择Bifidobacterium ado/escentis(B.adolescentis，青春双歧杆菌)，Bifidobacterium bifidum(B. bifidum，两歧双歧杆菌)，Bifidobacterium infantis(B。infantis，婴儿双歧杆菌)和Bifidobacterium longum(B.longum，长双歧杆菌)四株菌为出发菌株，采用Bacillus cereus(B. cereus，蜡状芽孢杆菌)和Eschenichia coli(E。coli，大肠杆菌)为指示菌进行发酵上清液的抗菌活性检测。实验结果表面四株双歧杆菌均有抑菌效果，对在对数生长期的E.coli的抑制率均在75%以上，其中B.infantis对E.coli AS1.543的抑制率达95%；而对在对数生长期的B.cereus的抑制率比对E.coli的低些，但也均在60%以上，其中B.longum对B.cereus的抑菌效果达到75%。在此基础上，选择B.Infantis和B.longum的发酵上清液进行蛋白酶酶解实验，结果确认了这些抑菌物质是一些蛋白质，而不是有机酸，对这些抑菌蛋白物质的抑菌热稳定性和pH稳定性的研究进一步确认了这些物质是一些细菌素或者是类细菌素物质。初步的实验结果表明来自B.Infantis的抑菌物质的热稳定性和pH稳定性都较B.longum的强，因此本论文选择Bifidobacterium infantis BCRC14602进行后续的实验，对其产生的抑菌物质进行分离纯化、鉴定及性质分析。
　　 由于来自Bifidobacterium infantis BCRC14602的类细菌素物质的性质和已经报道的细菌素性质较接近，它们也是分泌到发酵上清液。因此硫酸铵沉淀、与生产菌的吸附解吸、与硅酸吸附解吸等提取方法也适用于本菌株所产生的类细菌素物质的首步分离。在硫酸铵沉淀实验中，采用80%的硫酸铵和发酵上清液反应沉淀得到蛋白质，其含有的总抑菌活性达80%，比活力上升了4.56倍，回收产物经透析后比活力上升了76倍，但总活力仅剩8%。而在类细菌素物质与生产菌吸附和解吸试验中，类细菌素物质的吸附受发酵的pH影响显著，在pH6.0到7.0之间，死亡的细菌能100%吸附细菌素类物质，在pH1.5到2.0之间，类细菌素物质开始从生产菌上解吸。这种方法能将类细菌素物质纯化120倍，比活力达31605 AU/mg，得率为64%。在类细菌素物质与硅酸的吸附试验中，再次确认了类细菌素物质在硅酸(5%)上的吸附受发酵液pH影响显著。在pH5.0到7.0之间，吸附率达100%，当pH值低于5.0或高于7.0时，吸附率分别为67%和45%。本实验表明硅酸吸附解吸适合Bifidobacteriuminfantis BCRC14602中类细菌素物质的纯化，纯化倍数和回收率都较其它两种方法高。因此本文后续实验中类细菌素物质的首步分离将采用硅酸吸附解吸法。
　　 由于Bifidobacterium infantis BCRC14602所产的类细菌素物质对许多格兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制效果，我们将其定义为bifidin I，其抑菌模式与Lactobacillusplantarum(L.plantarum，植物乳杆菌)BCRC11697类似。对Bifidobacterium infantisBCRC14602使用MRS培养，37℃培养6小时后到对数中期，酶活为400 AU/ml，16小时后进入稳定期，最大酶活为1600 AU/ml。在纯化bifidin I的过程中，为了获得较高的回收率，本研究中采用了“三步走”的方法：第一步采用的是硅酸吸附解吸，得到的比活力为67696 AU/mg，回收率为80%；第二步采用的是阳离子交换层析，经NaCl梯度洗脱后得到的产物比活力上升到115315 AU/mg，回收率为64%；而最后一步采用的反向高效液相色谱，主峰的保留时间在36.88 min。整个流程下来，bifidin I总的纯化倍数为1390倍，得到的最终比活力为365714 AU/mg，总回收率为25.6%。在此基础上对纯化产物进行了Tricine-SDS-PAGE分析，纯化后bifidin I的相对分子质量约为3 kDa，在MALDI-TOF的检测实验中在2879.7 Da得到一个峰。将纯化产物用Edman降解法对N端的蛋白序列进行检测，得到了NH2-Lys-Tyr-Gly- Ser-Val-Pro-Leu-Gly的高疏水序列，这与已报道阳离子抗菌肽的特征相似，但其氨基酸序列与Genebank已报道细菌素序列未有重叠，说明它是一种新的乳酸菌细菌素，并从N端的NH2-Lys-Tyr判断它有可能是属于对李斯特菌具有特异抗菌特性的Ila类细菌素。
　　 最后对bifidin I的性质进行了考察，各类酶解实验表明蛋白酶酶解可以让bifidinI完全失活，而过氧化氢酶，α-淀粉酶和酯酶对其活力没有影响；bifidin I的热稳定性很高，在121℃处理15分钟，其活力没有任何损失；其活性在pH4到pH10的范围内稳定。根据bifidin I的分子量大小、李斯特菌抗性及部分已知氨基酸序列可初步判断它是一种未报道的细菌素，并基本可定义属于第二类细菌素。在此基础上对Bifidobacterium infantis BCRC14602进行了质粒消除实验，该菌株经过40μg/ml吖啶黄处理后可突变为Bif菌株，该突变株不产生bifidin I但是对bifidin I具有免疫性，由此可判断Bifidin I的产生与Bifidobacterium infantis BCRC14602中的一个质粒有关，但bifidin I的免疫性与此质粒无关。经过本实验研究，所获得的bifidin I具有很高的热稳定性和较宽的pH稳定性，这些将为此细菌素在食品加工和食品安全控制等领域的应用提供良好前提，也将为Bifidobacterium infantis BCRC14602作为益生菌在食品领域的应用提供了依据和理论基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：LIST OF FIGURES、LIST OF TABLES、LIST OF ABBREVIATIONS

声明

ACKNOWLEDGEMENTS

CHAPTER ONE：INTRODUCTION AND LITERATURE REVIEW

1.1. The Genus Bifidobacterium

1.2. Bifidobacterium Classification

1.3. Morphological and Physiological Characteristics of Bifidobacteria

1.3.1. Morphological Characteristics

1.3.2. Physiological Characteristics

1.4. Production and Purification of Antimicrobial Compounds from Bifidobacteria

1.4.1. Bacteriocins

1.4.2. Bacteriocin-Like Compounds

1.4.3. Other Antimicrobial Compounds

1.5. Bifidobacteria and Probiotics

1.5.1. Definition and Selection Criteria for Probiotics

1.5.2. Probiotic Health Effects from Bifidobacteria

1.6. Bacteriocins

1.6.1. Definition,History and Classification of Bacteriocins

1.6.2. Methods to Purify Bacteriocins

1.6.3. Applications of bacteriocins in Food

1.7. Aims and Objectives of the Study

1.8. References

CHAPTER TWO：SCREENING AND MEASURING METHODS OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVTY OF BIFIDOBACTERIUM SP.

2.1. Introduction

2.2. Material and Methods

2.2.1. Materials

2.2.2. Methods

2.3. Results and Discussion

2.3.1. Growth Properties of Bifidobacteria and Indicator Strains

2.3.2. Antimicrobial Activity of Bifidobacteria

2.3.3. Antimicrobial Effects of Bifidobacteria against the Indicator Strains in Skim Milk Medium

2.3.4. Effect of Enzymes and Detergents on the Antimicrobial Activity of the Bifidobacteria

2.3.5. Effect of the pH on the Antimicrobial Activity of the Bifidobacteria

2.3.6. Effect of the Heat Treatment on the Antimicrobial Activity of the Bifidobacteria

2.4. Conclusion

2.5. References

CHAPTER THREE：ISOLATION METHODS FOR THE BACTERIOCIN-LIKE INHITORY SUBSTANCES(BLIS)FROM BIFIDOBACTERIUM INFANTIS BCRC 14602

3.1. Introduction

3.2. MATERIAL AND METHODS

3.2.1. Materials

3.2.2. Methods

3.3. Results and Discussion

3.3.1. Antimicrobial Activity of B.infantis BLIS and Spectrum of Activity

3.3.2. Precipitation of B.infantis BLIS with Ammonium Sulphate

3.3.3. Adsorption and Desorption of B.infantis BLIS onto/from the Producer Cells

3.3.4. Adsorption and Desorption of B.infantis BLIS onto/from Silicic Acid(SA)

3.4. Conclusion

3.5. References

CHAPTER FOUR：PURIFICATION of BIFIDICIN I,A BACTERIOCIN PRODUCED BY BIFIDOBACTERIUM INFANTIS BCRC 14602

4.1. Introduction

4.2. Material and Methods

4.2.1. Materials

4.2.2. Methods

4.3. Results and Discussion

4.3.1. Antimicrobial Activity of B.infantis BCRC 14602 and Bifidin I Spectrum of Activity

4.3.2. Adsorption-Desorption of Bifidin I onto/from Silicic Acid

4.3.3. Purification of Bifidin I with Chromatographic Methods

4.3.4. Molecular Weight Determination

4.4. Conclusion

4.5. References

CHAPTER FIVE：CHARACTERIZATION OF BIFIDIN I; A BACTERIOCIN FROM BIFIDOBACTERIUM INFANTIS BCRC 14602

5.1. Introduction

5.2. Material and Methods

5.2.1. Materials

5.2.2. Methods

5.3. Results and Discussion

5.3.1. Production Kinetics of bifidin I

5.3.2. Mode of action

5.3.3. Effect of various enzymes,pH and,Heat Stability

5.3.4. Molecular mass estimation and amino acids sequence

5.3.5. Antilisterial activity of bifidin I

5.3.6. Plasmid Curing and Bifidin I Locus

5.4. Conclusion

5.5. References

CHAPTER SIX：GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS

6.1. Introduction

6.2. General Conclusion

6.2.1. Key Conclusions

6.2.2. Key Innovations

6.3. Recommendations

LIST OF PUBLICATIONS