Burkholderia mana SYBC LI-1产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究

摘要

脂肪酶是催化长链甘油三酰酯水解反应的酶，为重要的工业用酶之一。低温脂肪酶具有低温下高催化活性的特点，应用前景广阔。低温脂肪酶多数为极端嗜冷菌产生，极端嗜冷菌生长条件相对苛刻，产酶相对不易，严重制约了低温脂肪酶的发展。本论文从常温的自然生境土样中筛选出1株高产低温脂肪酶菌株。通过对其菌株形态、生理生化特性及16SrDNA分子鉴定，确定其为伯克霍尔德菌属(Burkholderia)，命名为BurkholderiamanaSYBCLI-1。 论文考察了菌株B.manaSYBCLI-1的摇瓶发酵培养情况，确定适宜的摇瓶发酵培养基为(g/L)：可溶性淀粉10、牛肉膏15、NaNO30.252、橄榄油40、OP10：在发酵条件为接种量为(V/V)10％，装液量为30mL/250mL，30℃，初始pH7.5，摇床转速200r/min，培养48h，脂肪酶酶活达85.23U/mL，较优化前提高了3.63倍。 论文对菌株B.manaSYBCLI-1脂肪酶的分离纯化进行了初步探讨，研究了硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀和双水相萃取(ATPS)3种大量纯化方法。其中ATPS适宜的体系为PEG2000(W/W)10％，K2HPO4(W/W)15％，pH8.0。在此条件下脂肪酶分配系数3.7，纯化系数4.1，回收率86.5％，对实际大规模制备有一定的参考价值。 论文还对B.manaSYBCLI-1脂肪酶粗酶的酶学性质进行了研究，结果表明：该酶的最适pH为9.5，有较宽的pH稳定性，在pH3.5～pH10之间相对酶活均超过75％。该脂肪酶的最适作用温度为20℃，0℃时仍保留约70％的酶活，属于低温脂肪酶；对热不敏感，70℃以下保温60min仍保持75％以上的酶活。在终浓度为1mmol/L时，Fe2+及Fe3+均有较大的激活作用，Co2+和EDTA则表现较强的抑制作用。此外，该酶还表现较好的耐醇性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1研究背景

1.1.1脂肪酶及其催化的反应

1.1.2脂肪酶的分类及来源

1.1.3脂肪酶的应用

1.1.4低温脂肪酶

1.2国内外研究进展

1.2.1产脂肪酶菌株的选育

1.2.2产脂肪酶微生物的发酵条件与培养基

1.2.3脂肪酶的分离纯化

1.2.4脂肪酶的酶学性质

1.3立题依据

1.3.1脂肪酶是重要的理论研究用酶

1.3.2脂肪酶是重要的工业用酶

1.3.3低温脂肪酶的意义

1.4本论文的主要研究内容

第二章脂肪酶高产细菌的筛选与鉴定

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果与分析

2.3.1菌的筛选

2.3.2菌株的形态学和生理生化特征

2.3.3产脂肪酶菌株基于16S rDNA序列的系统发育分析

2.3.4脂肪酶酶活测定方法比较

2.4讨论

第三章B.mana SYBC LI-1产脂肪酶摇瓶发酵条件优化

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3结果与分析

3.3.1 B.mana SYBC LI-1种子生长曲线

3.3.2发酵培养基的确定

3.3.4发酵培养条件的确定

3.3.5正交优化试验[85]

3.3.6优化前后B.mana SYBC LI-1产脂肪酶情况的比较

3.3.7优化前后B mana SYBC LI-1产脂肪酶摇瓶发酵曲线

3.4讨论

第四章B.mana SYBC LI-1脂肪酶分离纯化

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3结果与分析

4.3.1硫酸铵沉淀

4.3.2乙醇沉淀

4.3.3双水相萃取

4.3.4 3种纯化方法比较

4.3.5电泳分析

4.4讨论

第五章B.mana SYBC LI-1脂肪酶粗酶性质研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1实验材料

5.2.2实验方法

5.3结果与分析

5.3.1最适pH

5.3.2 pH稳定性

5.3.3最适温度

5.3.4温度稳定性

5.3.5金属离子或螯合物对酶活的影响

5.3.6有机溶剂对酶活的影响

5.4讨论

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

致谢

参考文献

附录 菌株B.mana SYBC LI-1的16S rDNA序列：

作者在攻读硕士学位期间发表的论文