柠檬酸单脂肪酸甘油酯的酶法合成及其性质研究

摘要

柠檬酸单脂肪酸甘油酯(CITREM)是甘油、脂肪酸以及柠檬酸(CA)的酯化产物。作为一种新型的阴离子表面活性剂，CITREM具有乳化、增稠、抗氧化及抗氧化增效等作用，广泛地应用于食品、医药和日化等工业。目前CITREM的合成方法主要是化学法，但化学合成法存在反应条件剧烈、随机性强、副产物多等缺点。有机相酶催化反应具有条件温和、专一性强等特点，能有效地克服化学合成法的缺点。本文采用有机相脂肪酶催化技术合成CITREM，对合成工艺、催化反应机理及产品性质进行了研究。主要研究内容及结果如下：
　　 ⑴在有机介质中催化CA和单甘酯(monoglyceride，MG)酯化合成CITREM，对脂肪酶和反应介质进行了筛选，最佳溶剂为无水叔丁醇，在所选5种脂肪酶中，Novozym435的催化活性最好，且最优条件为:CA浓度0.12mol/L，MG和CA摩尔比2:1，4A分子筛用量120g/L。在单因素试验的基础上，通过响应面分析法研究了Novozym435用量、反应温度和反应时间对CA转化率的影响，最佳工艺参数为:Novozym435用量9.02%，反应温度54.180℃，反应时间47.5h，在此条件下CA转化率可达77.37%。三个因素对CA转化率的影响:脂肪酶用量>反应时间>反应温度，三者的交互作用不显著。此外，Novozym435在最优条件下重复利用8次，其催化活力仍可保持92%左右。
　　 ⑵采用薄层色谱、电喷雾质谱和红外光谱对产物进行了定性分析。电喷雾质谱分析表明，产物主要为柠檬酸单脂肪酸甘油酯，此外含有少量的单甘油基柠檬酸、二甘油基柠檬酸和甘油基柠檬酸单脂肪酸甘油酯，副产物主要为脂肪酸。红外光谱分析表明，CITREM的柠檬酸主要在α-啦上。定性分析表明，有机相脂肪酶催化合成CITREM的反应是可行的，该反应具有专一性强、副产物少的特点。
　　 ⑶对Novozym435催化合成CITREM的反应机理进行了探讨。热力学分析表明，该酯化反应的Ea值为57.72kJ/mol，比通常脂肪酶催化脂肪酸酯化反应的Ea值要高。动力学分析表明，该酯化反应受到高浓度CA的抑制，并符合双底物乒乓机制，表观动力学常数:Vmxa=0.7142mmol/(g·min)，KB=0.0557mol/L，KA=0.0137mol/L，KiA=0.1945mol/L。
　　 ⑷对CITREM的表面活性和抗氧化活性进行了分析。CITREM的亲水亲油平衡值为8，临界胶束浓度为23.45μmol/L，乳化性优于MG，但乳化稳定性次于MG，起泡性和起泡稳定性都较差，不适合作发泡剂。体外抗氧化试验结果表明，CITREM对金属离子具有较强的络合作用，并具有清除羟自由基的能力，对二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)和超氧阴离子自由基无清除作用。CITREM对猪油和大豆油均有抗氧化作用，且对叔丁基对苯二酚(TBHQ)具有较好的抗氧化增效作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 绪论

1.1 柠檬酸单脂肪酸甘油酯简介

1.1.1 CITREM的应用

1.1.2 CITREM的合成

1.2 有机相脂肪酶催化反应研究进展

1.2.1 脂肪酶简介

1.2.2 有机相酶催化体系

1.3 本课题研究的意义和内容

1.3.1 立题意义

1.3.2 研究内容

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 原料分析

2.2.2 酶活的测定

2.2.3 有机溶剂的脱水处理

2.2.4 酶催化反应

2.2.5 柠檬酸的液相色谱(HPLC)分析

2.2.6 产物的定性分析

2.2.7 CITREM质量指标的测定

2.2.8 CITREM表面活性的分析

2.2.9 CITREM抗氧化活性的分析

3 结果与讨论

3.1 CITREM合成工艺的初步探索

3.2 CITREM合成工艺的优化

3.2.1 底物浓度对柠檬酸转化率的影响

3.2.2 底物摩尔比对柠檬酸转化率的影响

3.2.3 吸水剂用量对柠檬酸转化率的影响

3.2.4 脂肪酶用量对柠檬酸转化率的影响

3.2.5 反应温度对柠檬酸转化率的影响

3.2.6 反应时间对柠檬酸转化率的影响

3.2.7 响应面分析法确定最佳工艺参数

3.3 反应热力学分析

3.3.1 温度对初始反应速率的影响

3.3.2 利用Arrhenius公式求解表观活化能

3.4 反应动力学分析

3.4.1 摇瓶转速对反应初速率的影响

3.4.2 脂肪酶浓度对反应初速率的影响

3.4.3 底物浓度对反应初速率的影响

3.4.4 动力学方程的非线性拟合

3.4.5 动力学模型的验证及分析

3.5 脂肪酶的重复利用

3.6 产物的定性分析

3.6.1 薄层色谱(TLC)分析

3.6.2 电喷雾质谱(ESI-MS)分析

3.6.3 红外光谱(IR)分析

3.7 CITREM质量指标的测定

3.8 CITREM表面活性的分析

3.8.1 亲水亲油平衡值

3.8.2 临界胶束浓度

3.8.3 乳化性及乳化稳定性

3.8.4 起泡性及起泡稳定性

3.9 CITREM抗氧化活性的分析

3.9.1 CITREM对Fe2+的络合作用

3.9.2 CITREM对二苯基苦基苯肼自由基的清除作用

3.9.3 CITREM对羟自由基的清除作用

3.9.4 CITREM对超氧阴离子自由基的清除作用

3.9.5 CITREM对油脂的抗氧化及抗氧化增效作用

4 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士期间发表的论文