家蝇抗菌肽的分离及对细菌壁膜和DNA的作用

摘要

昆虫抗菌肽是昆虫免疫防御系统的重要成分，具有相对分子质量小、热稳定性好、抗菌谱广等特点。家蝇经常出没于杂菌横生的环境中，自身却不会被这些病原菌所感染，且在我国分布广泛、资源丰富，是一种亟待开发的良好资源。
　　 本研究以蝇蛆蛋白粉为材料，利用抗菌肽与细菌细胞的吸附结合特性建立了一种新的分离家蝇抗菌肽的方法，借助凝胶过滤层析、高效液相与MALDI-TOF/TOF-MS等手段，鉴定得到两种家蝇抗菌肽，定名为MDpep5和MDpep9。抗菌活性测定表明利用细胞膜结合原理分离家蝇抗菌肽切实可行，所得抗菌肽对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草杆菌与金黄色葡萄球菌均有抗菌活性，且均表现出的良好的热稳定性、对pH值和离子强度变化具有一定抵抗性。
　　 杀菌动力学、细菌细胞壁膜和细菌超微结构变化结果为细菌细胞壁膜是家蝇抗菌肽的作用靶点提供了证据。通过破坏膜结构，造成细胞内容物外泄，导致细胞死亡。同时也发现细菌细胞类型及抗菌肽结构差异也会影响肽与膜的相互作用，甚至对于某些细菌，在不造成其细胞壁膜损伤的前提下，家蝇抗菌肽仍然能够影响其正常的生理功能造成细胞死亡。表明针对不同类型细菌，家蝇抗菌肽具有独立的杀菌机制。
　　 胞内遗传物质DNA是家蝇抗菌肽的另一个作用靶点。家蝇抗菌肽在作用于细菌的过程中，能够引起细菌胞内染色体DNA、RNA、核苷酸等紫外吸收物质泄露，并导致细菌DNA的断裂；光谱学分析表明家蝇抗菌肽可与DNA发生相互作用。进一步研究抗菌肽对于DNA酶切的影响发现家蝇抗菌肽的能够加速DNA限制性内切酶酶切作用，促进DNA的降解；结合DNA圆二色谱分析表明家蝇抗菌肽与DNA结合后能够改变DNA构象，造成DNA双螺旋结构松散。推断家蝇抗菌肽具有类似于EcoR I非特异性结合DNA的性质，肽-DNA复合物的形成能够诱导DNA结构变化，双螺旋松散，从而使得更多的限制性内切酶酶切位点暴露，促进DNA的降解。
　　 综上所述，本研究利用抗菌肽与微生物细胞相互作用原理，建立了分析、定位与纯化抗菌肽的新方法，并借助该方法分离纯化得到家蝇抗菌肽MDpep5和MDpep9，分析了家蝇抗菌肽对于细菌的膜损伤及胞内DNA损伤机制，认为细菌细胞壁膜和胞内DNA是家蝇抗菌肽杀菌的两个重要作用靶点，其杀菌机理至少是这两个方面协同作用的结果。研究结果为家蝇抗菌肽的研究与开发利用提供了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 前言

1.2 蝇类抗菌肽的研究概况

1.3 抗菌肽的作用机理

1.3.1 细胞膜损伤

1.3.2 胞内损伤

1.4 抗菌肽的应用前景及存在的问题

1.4.1 应用前景

1.4.2 存在的问题

1.5 本课题的主要研究内容

参考文献

第二章 基于细胞膜结合原理分离家蝇抗菌肽

2.1 前言

2.2 材料与试剂

2.2.1 菌株

2.2.2 主要试剂

2.3 实验方法

2.3.1 蝇蛆蛋白干粉粗提物的制备

2.3.2 抗菌肽细菌吸附结合试验

2.3.3 凝胶过滤层析确定目标抗菌肽

2.3.4 反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化

2.4 结果与讨论

2.4.1 Sephadex G-15凝胶过滤分离家蝇抗菌肽

2.4.2 基于细胞膜结合原理分离家蝇幼虫抗菌肽

2.5 本章小结

参考文献

第三章 家蝇抗菌肽的结构鉴定及抗菌活性

3.1 前言

3.2 材料与试剂

3.2.1 菌株

3.2.2 主要材料与试剂

3.3 实验方法

3.3.1 MALDI-TOFTOF MS鉴定抗菌肽氨基酸序列

3.3.2 抗菌肽浓度的测定

3.3.3 细菌的培养

3.3.4 真菌的培养

3.3.5 抗菌肽抗真菌活性检测

3.3.6 抗菌肽对病原菌最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)

3.3.7 抗菌肽的抑菌动力学研究

3.3.8 稳定性检测

3.3.9 抗菌肽溶血性和凝集性

3.4 结果与讨论

3.4.1 MALDI-TOF/TOF-MS鉴定抗菌肽

3.4.2 最低抑菌浓度测定

3.4.3 家蝇抗菌肽MDpep5和MDpep9的抗菌动力

3.4.4 抗菌肽MDpep5和MDpep9对环境的敏感性

3.4.5 家蝇抗菌肽的溶血性

3.5 本章小结

参考文献

第四章 家蝇抗菌肽对不同类型细菌的细胞壁膜及胞内酶系的作用

4.1 前言

4.2 材料与试剂

4.2.1 菌株

4.2.2 主要试剂

4.3 实验方法

4.3.1 抗菌肽对细菌细胞壁作用检测

4.3.2 细胞表面微区低pH值对于家蝇抗菌肽表面疏水性影响

4.3.3 家蝇抗菌肽对细菌超微结构的影响

4.3.4 细菌细胞荧光标记

4.3.5 流式细胞仪(FCM)分析

4.4 结果与讨论

4.4.1 家蝇抗菌肽对细菌细胞壁的影响

4.4.2 细胞表面微区低pH值对于家蝇抗菌肽表面疏水性的影响

4.4.3 家蝇抗菌肽对细菌超微结构的影响

4.4.4 流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测细菌细胞受损情况

4.4.5 家蝇抗菌肽引发细菌细胞的业致死状态分析

4.5 本章小结

参考文献

第五章 家蝇抗菌肽与细菌DNA的作用研究

5.1 前言

5.2 材料与试剂

5.2.1 菌株

5.2.2 主要试剂

5.3 实验方法

5.3.1 抗菌肽与细菌作用后对染色体DNA的影响

5.3.2 细菌紫外吸收物的渗透检测

5.3.3 凝胶电泳检测抗菌肽与DNA的结合

5.3.4 原子力显微镜(AFM)检测抗菌肽与DNA的结合

5.3.5 抗菌肽与细菌DNA相互作用的紫外光谱分析

5.3.6 抗菌肽与细菌DNA结合的荧光光谱

5.3.7 抗菌肽与细菌DNA相互作用的荧光光谱分析

5.3.8 抗菌肽对EB—DNA复合体系滴定的荧光光谱

5.3.9 EB对复合体系抗菌肽—DNA滴定的荧光光谱

5.4 结果与讨论

5.4.1 细菌物质的泄露的紫外吸收分析

5.4.2 家蝇抗菌肽对细菌DNA的损伤

5.4.3 凝胶电泳检测家蝇抗菌肽与细菌DNA的结合

5.4.4 原子力显微镜检测家蝇抗菌肽与DNA的作用

5.4.5 紫外光谱法检测家蝇抗菌肽与细菌DNA相互作用

5.4.6 家蝇抗菌肽与细菌DNA结合的荧光光谱

5.4.7 家蝇抗菌肽与溴化乙锭竞争结合细菌DNA

5.5 本章小结

参考文献

第六章 家蝇抗菌肽引起细菌DNA降解的机理探讨

6.1 前言

6.2 材料与试剂

6.2.1 菌株

6.2.2 主要试剂

6.3 实验方法

6.3.1 染色体DNA酶切实验

6.3.2 不同浓度抗菌肽对DNA酶切程度的影响

6.3.3 圆二色光谱

6.4 结果与讨论

6.4.1 细菌DNA限制性内切酶酶切实验

6.4.2 不同浓度家蝇抗菌肽对细菌DNA酶切的影响

6.4.3 家蝇抗菌肽对于细菌DNA构象的影响

6.5 本章小结

参考文献

论文主要结论与创新点

攻读博士学位期间发表论文清单

致谢